孔令麒，錢海珊，李紹花，陳帥，黃豐，何紅平，李寶晶

1云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院云南省南藥可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2云南中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，所有肝癌病例中90%以上是肝細(xì)胞癌[1-2]。臨床肝癌治療策略包括手術(shù)切除、放療和化療等，但患者預(yù)后仍不理想[3]。因此，開(kāi)發(fā)安全性高、毒性作用小的新藥具有重要意義。蟾皮為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍的干燥皮，其性涼，味辛，微毒，具有清熱解毒、利水消脹的功效，可治癰疽、腫毒、瘰疬、疳積腹脹[4]。華蟾素注射液為蟾皮的水提取物，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療，如肝癌、胃癌等[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類化合物是其主要成分，部分蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類化合物對(duì)HepG2、A549、HeLa細(xì)胞具有體外增殖抑制作用[6]。沙蟾毒精是蟾皮中主要的蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類化合物之一?，F(xiàn)代藥理研究表明，沙蟾毒精具有良好的抗腫瘤活性[7-9]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步明確。2020年9月—2021年8月，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，觀察了沙蟾毒精對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行探討，為沙蟾毒精的抗腫瘤應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 沙蟾毒精從蟾皮中分離獲得[10]，經(jīng)高效液相（HPLC）檢測(cè)純度超過(guò)98%。人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；胰酶購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-8、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）試劑盒均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；GAPDH小鼠單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；p-STAT3兔單克隆抗體、p-JAK2兔單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；p-JAK1兔多克隆抗體購(gòu)自江蘇親科生物研究中心有限公司。倒置熒光顯微鏡（MF53）購(gòu)于廣州明美光電有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（WD-2102B）、蛋白垂直電泳儀（DYY-6C）購(gòu)于北京六一生物科技有限公司；低溫高速離心機(jī)（TGL-16D）購(gòu)于常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；Novo-Cyte?流式細(xì)胞儀（NovoCyte 2060R）購(gòu)于艾森生物（杭州）有限公司；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（BPN-80CW）購(gòu)于上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 沙蟾毒精對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響觀察

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%后，棄培養(yǎng)上清液，PBS洗2遍后加入胰酶消化2 min，加入培養(yǎng)基終止消化并重懸細(xì)胞，收集細(xì)胞至離心管，1 000 r/min離心3 min，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞存活率測(cè)算 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按1×106/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，設(shè)對(duì)照組和不同濃度實(shí)驗(yàn)組，每組5個(gè)復(fù)孔。待第2天細(xì)胞貼壁后去除原培養(yǎng)液，PBS洗2次，對(duì)照組加入DMEM完全培養(yǎng)基、每孔100μL，實(shí)驗(yàn)組分別加入含5、10、20、40、80 nmol/L沙蟾毒精的DMEM完全培養(yǎng)基、每孔100μL。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加CCK-8檢測(cè)試劑10μL，37℃恒溫孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔光密度值并計(jì)算細(xì)胞存活率。選用HepG2細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)增殖抑制時(shí)的沙蟾毒精濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最高濃度，逐級(jí)減半分別為中劑量和低劑量組的作用濃度。

1.3 沙蟾毒精對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)及凋亡的影響觀察

1.3.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以1×106/mL接種于96孔培養(yǎng)板、每孔100μL，設(shè)對(duì)照組和沙蟾毒精低、中、高劑量組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁24 h后，棄去原培養(yǎng)液，PBS洗2次。對(duì)照組加入DMEM完全培養(yǎng)基，每孔100μL。沙蟾毒精低、中、高劑量組分別加入含1.25、2.5、5 nmol/L沙蟾毒精的DMEM完全培養(yǎng)基，每孔100μL。培養(yǎng)48 h，采用倒置熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡 分組及給藥方法參考“1.3.1”。各組培養(yǎng)48 h，PBS洗2遍后加胰酶消化2 min，收集細(xì)胞，1 500 r/min離心3 min，洗2遍后稀釋。取1×Binding Buffer 300μL重懸細(xì)胞，每管中加入Annexin V-FITC 3μL、PI-PE 5μL，孵育 10 min，再加入 1×Binding Buffer 200μL，混勻后上流式細(xì)胞儀觀察并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4 沙蟾毒精對(duì)HepG2細(xì)胞腫瘤免疫相關(guān)因子分泌水平的影響觀察 分組及給藥方法參考“1.3.1”。各組培養(yǎng)48 h，離心后收集上清液。采用ELISA法檢測(cè)上清液中的IL-6、IL-8、TGF-β1、VEGF。

1.5 沙蟾毒精與JAK/STAT3信號(hào)通路作用關(guān)系驗(yàn)證

1.5.1 沙蟾毒精與JAK1、JAK2、STAT3蛋白分子對(duì)接 通過(guò)PBD數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）下載JAK1、JAK2、STAT3蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載沙蟾毒精的分子結(jié)構(gòu)。采用Autodock tools1.5.6和PyMol2.4.1軟件對(duì)沙蟾毒精和各蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。采用Autodock vina1.1.2軟件對(duì)受體蛋白和沙蟾毒精進(jìn)行分子對(duì)接和結(jié)合能打分，結(jié)合能越低表明親和力越好。對(duì)接過(guò)程中對(duì)接20次獲得20個(gè)可能結(jié)合的構(gòu)象，選取親和力最佳的構(gòu)象，借助Discovery Studio 4.5 Visualizer軟件進(jìn)行可視化分析。

1.5.2 JAK/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以1×106/mL接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL。設(shè)對(duì)照組和沙蟾毒精低、中、高劑量組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，PBS洗2次。對(duì)照組加入DMEM完全培養(yǎng)基，每孔2 mL；沙蟾毒精低、中、高劑量組分別加入含1.25、2.5、5 nmol/L沙蟾毒精的DMEM完全培養(yǎng)基，每孔2 mL。作用48 h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白。BCA法測(cè)定總蛋白濃度，加入上樣5×緩沖液混勻，煮沸5 min。加入一定體積的蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳，80 V恒壓電泳1.5 h，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂牛奶封閉液封閉1 h，孵育一抗過(guò)夜，TBST清洗3次。PVDF膜孵育二抗2 h，TBST洗3次。置于超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)運(yùn)行程序顯影成像。以目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（IQR）表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沙蟾毒精對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 5、10、20、40、80 nmol/L的沙蟾毒精作用24、48、72 h后HepG2細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組（P均＜0.01），詳見(jiàn)表1。選擇5 nmol/L作為最高作用濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 各組HepG2細(xì)胞存活率比較（%，±s）

表1 各組HepG2細(xì)胞存活率比較（%，±s）

注：與對(duì)照組相比，**P＜0.01。

組別實(shí)驗(yàn)組5 nmol/L 10 nmol/L 20 nmol/L 40 nmol/L 80 nmol/L對(duì)照組細(xì)胞存活率24 h 48 h 72 h 30.29±2.15**18.92±1.13**12.81±1.54**6.00±0.29**4.65±0.84**100.00±3.45 67.98±3.25**52.15±3.02**41.80±3.75**30.75±2.98**18.54±1.63**100.00±3.63 49.68±2.63**27.68±2.19**17.06±2.28**15.82±2.37**10.77±1.40**100.00±2.37

2.2 沙蟾毒精對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好，細(xì)胞與細(xì)胞之間呈現(xiàn)緊密連接的狀態(tài)。沙蟾毒精低、中、高劑量組細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞間隙增大，部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。見(jiàn)圖1。

圖1 沙蟾毒精對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3 沙蟾毒精對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組和沙蟾毒精低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率分別為4.12%±0.16%、10.29%±0.36%、13.72%±0.70%、31.61%±4.06%，沙蟾毒精低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，沙蟾毒精低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率依次增高（P均＜0.05）。

2.4 沙蟾毒精對(duì)HepG2細(xì)胞腫瘤免疫相關(guān)因子分泌水平的影響 沙蟾毒精低、中、高劑量組細(xì)胞上清液IL-6、TGF-β1、VEGF水平低于對(duì)照組，沙蟾毒精低、中、高劑量組細(xì)胞上清液IL-6、TGF-β1、VEGF水平依次降低（P均＜0.05）；沙蟾毒精中、高劑量組細(xì)胞上清液IL-8水平低于對(duì)照組，沙蟾毒精低、中、高劑量組細(xì)胞上清液IL-8水平依次降低（P均＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 各組HepG2細(xì)胞上清液IL-6、IL-8、TGF-β1、VEGF水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組HepG2細(xì)胞上清液IL-6、IL-8、TGF-β1、VEGF水平比較（pg/mL，±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與沙蟾毒精低劑量組相比，#P＜0.05；與沙蟾毒精中劑量組相比，△P＜0.05。

組別沙蟾毒精高劑量組沙蟾毒精中劑量組沙蟾毒精低劑量組對(duì)照組VEGF 27.43±3.07*#△37.05±3.51*#46.22±8.34*58.81±3.99 IL-6 5.02±0.68*#△6.63±0.18*#7.68±0.73*10.53±2.04 IL-8 23.35±1.25*#△28.34±1.22*#39.00±5.66 41.74±4.15 TGF-β1 24.14±3.23*#△35.30±2.82*#39.80±1.52*45.05±5.21

2.5 沙蟾毒精與JAK/STAT3信號(hào)通路的作用關(guān)系 分子對(duì)接結(jié)果顯示，沙蟾毒精與JAK1、JAK2、STAT3有良好的親和力，結(jié)合能分別為-8.0、-7.2、-8.4 kcal/mol。沙蟾毒精中、高劑量組細(xì)胞中p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于沙蟾毒精低劑量組和對(duì)照組，沙蟾毒精高劑量組p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于沙蟾毒精中劑量組（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞中p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組細(xì)胞中p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與沙蟾毒精低劑量組相比，#P＜0.05；與沙蟾毒精中劑量組相比，△P＜0.05。

p-STAT3 0.45±0.04*#△0.59±0.05*#0.73±0.07 0.88±0.04組別沙蟾毒精高劑量組沙蟾毒精中劑量組沙蟾毒精低劑量組對(duì)照組p-JAK1 0.84±0.05*#△1.23±0.17*#1.71±0.14 1.96±0.06 p-JAK2 0.51±0.06*#△0.78±0.10*#1.06±0.06 1.22±0.07

3 討論

肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)肝癌發(fā)病率與病死率呈上升趨勢(shì)，治療效果不理想。中藥抗肝癌具多效應(yīng)、多靶點(diǎn)、多層次等特點(diǎn)，治療效果顯著，可延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，且不良反應(yīng)小，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[11]。目前中藥抗腫瘤主要表現(xiàn)在：提高機(jī)體免疫，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；調(diào)節(jié)特定信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡與自噬；抑制腫瘤血管生成；抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移[12]。沙蟾毒精是從中藥蟾皮中分離得到的一種天然活性物質(zhì)。近年來(lái)，蟾皮類制劑廣泛用于治療各種惡性腫瘤、心臟疾病、疼痛、感染性疾病等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類具有良好的抗腫瘤和抗輻射作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，觀察了沙蟾毒精對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響，對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行探討。研究結(jié)果顯示，沙蟾毒精可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低腫瘤免疫相關(guān)因子IL-6、IL-8、TGF-β1、VEGF分泌水平，且作用呈一定的劑量依賴性。分子對(duì)接結(jié)果顯示，沙蟾毒精與JAK1、JAK2、STAT3有良好的親和力，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示，沙蟾毒精作用后，肝癌細(xì)胞中p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，且沙蟾毒精高劑量組p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于沙蟾毒精中劑量組。以上結(jié)果提示，沙蟾毒精對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制、促凋亡等作用可能與其直接作用于JAK-STAT信號(hào)通路有關(guān)。

JAKs家族屬于非受體型酪氨酸激酶，包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。STATs為其下游底物，迄今為止發(fā)現(xiàn)有7個(gè)成員，包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B 和 STAT6。JAK/STAT3信號(hào)通路由配體與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合所激活。受體與配體的結(jié)合導(dǎo)致受體齊聚化，進(jìn)而激活JAK激酶，激活的JAKs磷酸化受體上的特征酪氨酸殘基，以創(chuàng)建STATs的對(duì)接位點(diǎn)。在與受體對(duì)接時(shí)，JAKs磷酸化STATs蛋白SH2結(jié)構(gòu)域和C端，反式激活結(jié)構(gòu)域之間的保守酪氨酸殘基，形成二聚體，進(jìn)而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與靶基因結(jié)合，最終調(diào)控基因表達(dá)[13-14]。JAK/STAT3 信號(hào)通路主要由 JAK、STAT3組成，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[15-16]。

JAK/STAT3通路功能失調(diào)被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)病的關(guān)鍵因素[17]。ZHANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者腫瘤組織中JAK2、STAT3表達(dá)高于癌旁組織，且miRNA-402高表達(dá)能下調(diào)HepG2細(xì)胞中JAK2、STAT3表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CKS1B基因表達(dá)，可通過(guò)抑制JAK/STAT3通路激活從而影響肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力和凋亡[19]。潘奇等[20]分析不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞系細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子活性差異，發(fā)現(xiàn)STAT3的活性隨著肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的增加而增加，提示STAT3的活性異常與肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

炎癥是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要促進(jìn)因素。IL-6參與了腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6水平升高可導(dǎo)致JAK/STAT3信號(hào)通路過(guò)度激活，JAK/STAT3信號(hào)通路過(guò)度活化也會(huì)誘導(dǎo)IL-6分泌，從而產(chǎn)生正反饋回路[21]。IL-8是一種具有趨化作用的細(xì)胞因子，其功能包括免疫作用、刺激血管生成和刺激腫瘤細(xì)胞增殖[22]。腫瘤患者的IL-8主要是由腫瘤細(xì)胞自身產(chǎn)生，其血清濃度與腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān)[23]。VEGF在血管生成中起著至關(guān)重要的作用，并驅(qū)動(dòng)各種致癌過(guò)程[24]。TGF-β在腫瘤發(fā)生中具有雙重作用，早期可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，隨著腫瘤進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞逐漸對(duì)其不敏感，分泌的TGF-β蛋白增強(qiáng)了腫瘤免疫抑制，促進(jìn)腫瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[25]。

長(zhǎng)期以來(lái)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療相關(guān)研究的熱點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，沙蟾毒精能抑制HepG2細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡，并抑制炎癥因子IL-6、IL-8、TGF-β1和VEGF的分泌，機(jī)制可能與調(diào)控JAK/STAT3信號(hào)通路相關(guān)。然而，細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制不僅僅局限于JAK/STAT3信號(hào)通路，其具體聯(lián)系還需進(jìn)一步研究。