徐彥楠，趙青 ，趙俊霞，周娜靜，高品，周晨明

1河北醫(yī)科大學(xué)教學(xué)實驗中心，石家莊 050017；2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院眼科；3河北醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室；4河北醫(yī)科大學(xué)大型科研儀器設(shè)備共享服務(wù)平臺

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，病死率較高，嚴(yán)重威脅患者生命健康安全[1]。盡管近年來乙肝疫苗得到普及、人們生活水平明顯提高，但我國肝癌發(fā)病率仍相對較高[2]。臨床治療肝癌以化療為主要手段，但不良反應(yīng)較重、易產(chǎn)生耐藥性，治療效果不佳[3]，迫切需要尋找和研發(fā)新型高效的抗肝癌藥物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥提取物能通過影響腫瘤細(xì)胞凋亡而表現(xiàn)出抗腫瘤作用，且呈多靶點作用，毒性較小，特異性強[4]。異牛肝菌素是一種從褐環(huán)粘蓋牛肝菌中分離得到的單體化合物，與之前研究發(fā)現(xiàn)的牛肝菌素是同分異構(gòu)體，屬于聚異戊二烯酚類化合物[5]。臨床研究表明，異牛肝菌素對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，如人胃癌BGC-823細(xì)胞株、人肺腺癌A549細(xì)胞株、人慢性髓系白血病K562細(xì)胞株等，且對正常淋巴細(xì)胞無毒性作用[6-8]。但異牛肝菌素對人肝癌HepG2細(xì)胞株的作用及機制鮮有報道。2021年1月—12月，本研究觀察了異牛肝菌素對人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖和凋亡的影響，并基于磷脂酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路探討相關(guān)作用機制，為新型抗腫瘤藥物的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實驗材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2購于北京晶萊華科生物技術(shù)有限公司。異牛肝菌素由河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，濃度≥98%，實驗前用完全培養(yǎng)液稀釋為50.0μg/mL；PI3K/Akt通路激活劑Fumonisin B1購于上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購于美國Invitrogen公司；胎牛血清購于美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素購于上海依赫生物科技有限公司；鼠抗人Bax單克隆抗體購于艾美捷Trevigen公司；鼠抗人Bcl-2單克隆抗體購于上海翌圣生物科技股份有限公司；兔抗人Caspase-3單克隆抗體購于北京百奧博科技有限公司；兔抗人PI3K、pPI3K、pAkt單克隆抗體購于英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購于石四藥-翰林生物公司；乙二胺四乙酸（EDTA）購于美國Sigma公司；內(nèi)參兔β-actin多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。MTT試劑盒購于上海齊源生物科技有限公司；Hoechst333258購于上海士鋒生物科技有限公司；RIPA裂解液購于上?？道缮锟萍加邢薰荆籅CA蛋白濃度測定試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號AHW-80L）購于上海目尼實驗設(shè)備有限公司；振蕩器（型號ZW-A）購于蘇州市國飛實驗室儀器有限公司；全自動酶標(biāo)儀（型號ELX900）購于美國Bio-Tek公司；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)購于美國LI-COR公司；BX51熒光倒置顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞分組與異牛肝菌素用法 HepG2接種于含 10%FBS、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 U/mL）的DMEM培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為適宜飽和濕度、37℃、5% CO2。定期更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%密度時，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入0.04%EDTA消化液5 mL，混勻后吸去胰酶溶液，37℃下放置5 min，再加入2 mL含10%FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)至80%～90%密度待用。將細(xì)胞分為異牛肝菌素組、激活劑組、對照組。取第三代對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至6×107/L，胰酶消化，接種于96孔培養(yǎng)板、100μL/孔，每組設(shè)置6個復(fù)孔。將接種好的培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱（適宜飽和濕度、37℃、5% CO2）中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，棄去舊培養(yǎng)液。異牛肝菌素組加入50μg/mL的異牛肝菌素；激活劑組加入50μg/mL的異牛肝菌素和20μg/mL的Fumonisin B1；對照組為細(xì)胞懸液，僅加入等容量生理鹽水，不加任何藥物。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率測算 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液100μL，避光條件下加入5 mg/mL的MTT液10μL，避光條件下孵育4 h，每孔加入DMSO 150μL，然后置于振蕩器上，于室溫下振蕩10 min。采用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測光密度（OD）值，重復(fù)測量3次。計算HepG2細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡情況觀察 各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)液，采用4%中性甲醛固定細(xì)胞20 min，棄去固定液，PBS洗滌2次，吸盡液體；每孔加入Hoechst333258染液100 μL，室溫下染色10 min，吸盡染液，PBS洗滌2次；每孔加入適量熒光淬滅劑，于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照，細(xì)胞核明顯濃縮為凋亡細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白及PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白檢測 采用Western blotting法。各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)液，終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，吸盡液體；加入事先預(yù)冷的RIPA裂解液，于4℃下裂解細(xì)胞30 min；提取各組細(xì)胞總蛋白，將蛋白質(zhì)溶液與等量上樣緩沖液混合，經(jīng)10% SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉3 h；分別加入 Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K、pPI3K、pAkt單克隆抗體，在4℃下孵育過夜，TBS漂洗1次；添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，于37℃下孵育2 h，TBS漂洗3次；滴加事先按1∶1混合好的化學(xué)發(fā)光液，室溫孵育3 min，吸去多余的化學(xué)發(fā)光試劑，將NC膜放入凝膠成像系統(tǒng)中進行發(fā)光、照相，測定各蛋白條帶的積分光密度（IOD）值。以目的蛋白條帶IOD值與β-actin條帶IOD值的比值表示目的蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。采用K-W檢驗分析計量資料正態(tài)分布性，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞OD值與增殖抑制率比較 干預(yù)24、48、72 h后，異牛肝菌素組細(xì)胞OD值低于激活劑組與對照組，細(xì)胞增殖抑制率高于激活劑組與對照組（P均＜0.05）。隨時間延長，異牛肝菌素組OD值呈降低趨勢，細(xì)胞增殖抑制率呈升高趨勢；對照組與激活劑組OD值呈增高趨勢（P均＜0.05）。詳見表1。

表1 干預(yù)不同時間各組細(xì)胞OD值及增殖抑制率比較（±s）

表1 干預(yù)不同時間各組細(xì)胞OD值及增殖抑制率比較（±s）

注：與同組干預(yù)24 h后相比，aP＜0.05；與同組干預(yù)48 h后相比，bP＜0.05；與同時點對照組、激活劑組相比，cP＜0.05。

組別異牛肝菌素組激活劑組對照組OD值增殖抑制率（%）72 h 87.68±0.51abc 0.00±0.00 0.00±0.00 24 h 0.302±0.001c 1.239±0.002 1.241±0.003 48 h 0.258±0.001ac 1.392±0.002a 1.394±0.002a 72 h 0.179±0.001abc 1.441±0.002a 1.443±0.003a 24 h 76.37±1.12c 0.00±0.00 0.00±0.00 48 h 81.56±0.89ac 0.00±0.00 0.00±0.00

2.2 各組細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達比較 異牛肝菌素組、激活劑組、對照組細(xì)胞凋亡率分別為68.37% ±2.16%、6.01% ±0.69%、6.12% ±0.72%，異牛肝菌素組細(xì)胞凋亡率高于激活劑組和對照組（P均＜0.05）。異牛肝菌素組細(xì)胞Bax、Caspase-3蛋白表達高于激活劑組和對照組，Bcl-2蛋白表達低于激活劑組和對照組（P均＜0.05）。見表2、圖1。

表2 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達比較（±s）

表2 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達比較（±s）

注：與對照組相比，aP＜0.05，與激活劑組相比，bP＜0.05。

組別異牛肝菌素組激活劑組對照組Caspase-3 0.67±0.01ab 0.28±0.03 0.26±0.02 Bax 0.58±0.04ab 0.18±0.02 0.17±0.01 Bcl-2 0.34±0.02ab 0.86±0.09 0.87±0.08

圖1 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達情況

2.3 各組細(xì)胞中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達比較 異牛肝菌素組PI3K、pPI3K、pAkt蛋白表達低于激活劑組和對照組（P均＜0.05）。見表3、圖2。

表3 各組細(xì)胞中PI3K、pPI3K、pAkt蛋白表達比較（±s）

表3 各組細(xì)胞中PI3K、pPI3K、pAkt蛋白表達比較（±s）

注：與對照組相比，aP＜0.05，與激活劑組相比，bP＜0.05。

組別異牛肝菌素組激活劑組對照組PI3K 0.54±0.03ab 0.83±0.09 0.85±0.07 pPI3K 0.53±0.02ab 0.82±0.05 0.83±0.04 pAkt 0.51±0.01ab 0.78±0.08 0.79±0.06

圖2 各組細(xì)胞中PI3K、pPI3K、pAkt蛋白表達情況

3 討論

肝癌是是常見的消化道惡性腫瘤，病死率較高，嚴(yán)重危及患者生命安全，因此肝癌的防治工作仍任重道遠(yuǎn)[9]。早期肝癌患者可接受外科手術(shù)切除治療，效果相對較好，5年生存率在40%～70%。但肝癌起病較為隱匿，早期通常沒有癥狀或癥狀不典型，確診時多已發(fā)展至中晚期，導(dǎo)致患者失去手術(shù)治療的機會[10-12]。中晚期肝癌治療以化療為主，但化療會產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，有30%～80%的患者出現(xiàn)腫瘤耐藥[13]。基于此，尋找新型、高效、毒性低的抗肝癌藥物具有重要意義。

肝癌細(xì)胞無限生長的原因在于腫瘤細(xì)胞增殖失控與凋亡受阻。細(xì)胞凋亡是維持機體正常生命活動必不可少的程序，而腫瘤細(xì)胞凋亡障礙能較大程度地影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。如何促使腫瘤細(xì)胞凋亡在腫瘤治療中意義重大[14]。通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而控制腫瘤生長，是目前多數(shù)抗腫瘤藥物的主要作用機制之一。褐環(huán)粘蓋牛肝菌是一種食用兼藥用的大型真菌，異牛肝菌素是從其中提取的一種天然化合物。異牛肝菌素表現(xiàn)出較強的生物活性，其在體外能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。本研究觀察了異牛肝菌素對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，異牛肝菌素組隨用藥時間延長而OD值減小、細(xì)胞增殖抑制率升高，且異牛肝菌素組細(xì)胞增殖抑制率高于激活劑組和對照組。同時，Hoechst333258熒光染色結(jié)果顯示，對照組與激活劑組細(xì)胞形態(tài)正常，呈藍(lán)色熒光，分布均勻，異牛肝菌素組同一視野下細(xì)胞數(shù)目明顯減少，被染成亮藍(lán)色，核固縮，染色質(zhì)凝聚，有凋亡小體出現(xiàn)，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。異牛肝菌素組細(xì)胞凋亡率高于激活劑組和對照組。上述研究結(jié)果提示，異牛肝菌素對人肝癌HepG2細(xì)胞具有較強的抑制效果，有成為新型抗腫瘤藥物的可能。

研究表明，Bcl-2家族蛋白和Caspase家族蛋白與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Bcl-2蛋白存在于線粒體膜，能保護膜通透性，同時能與Bax形成異源二聚體，抑制Bax的促凋亡活性。因此，Bax/Bcl-2比值能反映Bcl-2家族蛋白對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[16]。Caspase家族中的Caspase-3蛋白參與細(xì)胞凋亡啟動和執(zhí)行過程，其表達量能反映Caspase家族蛋白對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，亦是參與細(xì)胞凋亡最重要的調(diào)控蛋白[17]。本研究結(jié)果顯示，異牛肝菌素組細(xì)胞中Bax、Caspase-3蛋白表達高于激活劑組和對照組，Bcl-2蛋白表達低于激活劑組和對照組，這提示異牛肝菌素可能通過調(diào)控Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達從而發(fā)揮促進肝癌細(xì)胞凋亡的作用。

PI3K/Akt信號通路是參與細(xì)胞生長、代謝、凋亡及轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)通路，其在多數(shù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達失調(diào)[18]。臨床研究表明，肝癌的發(fā)生發(fā)展與PI3K/Akt信號通路關(guān)系密切[19]。PI3K 是 PI3K/Akt信號通路的核心，能夠特異性催化磷酸肌醇-3-位羥基磷酸化，產(chǎn)生肌醇脂物質(zhì)，進一步激活或募集通路下游靶蛋白產(chǎn)生一系列信號級聯(lián)反應(yīng)。Akt被激活后能從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞膜，并促進磷酸化的發(fā)生，進而激活或抑制PI3K/Akt信號通路的下游靶蛋白，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖或凋亡過程[20]。鑒于此，本研究基于PI3K/Akt信號通路探討異牛肝菌素對人肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控機制，結(jié)果顯示，異牛肝菌素組細(xì)胞PI3K、pPI3K、pAkt蛋白表達低于激活劑組和對照組，提示異牛肝菌素抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用可能與抑制PI3K/Akt信號通路相關(guān)。同時，激活劑組與對照組PI3K、pPI3K、pAkt蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異，提示PI3K/Akt通路被激活后，異牛肝菌素?zé)o法再發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，異牛肝菌素可抑制HepG2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，作用機制可能與抑制PI3K/Akt通路有關(guān)。