陳小君 孟淑娟 龐淑蘭 王偉軒 張艷淑

1華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 河北唐山 063210；2曹妃甸區(qū)臨港醫(yī)院；3唐山弘慈醫(yī)院病理科

鉛是廣泛存在于生活和工作環(huán)境中的有毒顆粒物，可以通過呼吸道進入機體，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力和神經(jīng)功能降低，出現(xiàn)焦慮抑郁等神經(jīng)行為[1]。肥胖與遺傳高度相關(guān)[2]，不僅是心血管疾病、糖尿病和癌癥的誘發(fā)形式，也為肥胖癥與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系和機制研究提供新契點。研究表明肥胖與情緒癥狀和認知功能障礙的高患病率相關(guān)，也是心血管疾病、糖尿病等疾病并發(fā)癥的主要危險因素[3]。關(guān)于鉛暴露對神經(jīng)損傷的機制一直以來存在多種說法。有報道鉛暴露可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進而損傷神經(jīng)細胞，導(dǎo)致細胞凋亡[4]。鐵死亡(ferroptosis)于 2012年由Dixon SJ等[5]發(fā)現(xiàn)，是一種依賴于鐵和活性氧并以脂質(zhì)氧化為特征的、不同于細胞凋亡的新類型的細胞死亡方式。細胞鐵死亡在細胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化酶4(GLutathione peroxidase 4，GPX4)、Xc-、GCH1等抗氧化系統(tǒng)被藥物學(xué)或者遺傳學(xué)手段抑制時發(fā)生[6]。GPX4以谷胱甘肽(Glutathione，GSH)為還原劑，催化脂質(zhì)過氧化物還原成對應(yīng)的醇，從而保護細胞免受脂質(zhì)過氧化損傷。胱氨酸/谷氨酸逆蛋白轉(zhuǎn)運體Xc-系統(tǒng)由催化亞基SLC7A11和伴侶亞基SLC3A2組成，SLC7A11屬于溶質(zhì)載體家族成員的一種，其介導(dǎo)的胱氨酸和谷氨酸的攝取和釋放過程在抑制氧化反應(yīng)和維持氧化應(yīng)激條件下的細胞存活中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，可作為機體抗氧化潛能的一個重要指標，可以反映生物機體經(jīng)歷脂質(zhì)過氧化速率和強度，與神經(jīng)損傷的嚴重程度密切相關(guān)。研究表明，鐵死亡可以導(dǎo)致許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病[7]。但是鉛暴露引起肥胖小鼠皮質(zhì)鐵死亡未見報道。本研究以鉛暴露肥胖小鼠為模型，分析鐵死亡中抗氧化系統(tǒng)相關(guān)氧化損傷指標，探討鉛暴露對肥胖小鼠皮質(zhì)鐵死亡的影響，以期為鉛暴露神經(jīng)損傷的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物及處理 雄性成年C57小鼠48只，動物證號:SCXK(京)2020-004。按照體質(zhì)量隨機分為4組，即對照組、鉛暴露組、肥胖組和鉛暴露+肥胖組，每組12只小鼠。其中對照組、鉛暴露組小鼠分別給予自由飲水、250mg/L醋酸鉛飲水，肥胖組、鉛暴露+肥胖小鼠除給予高脂飼料外，分別給予自由飲水、250mg/L 醋酸鉛飲水。以肥胖組與鉛暴露+肥胖組小鼠平均體質(zhì)量不低于對照小鼠平均體質(zhì)量的120%，判定肥胖模型小鼠造模成功。染毒時間為 24周。本研究經(jīng)華北理工大學(xué)實驗動物倫理委員會審查批準。

1.2神經(jīng)行為檢測

1.2.1曠場試驗(Open field test，OFT) 該試驗用于評價鉛暴露對實驗小鼠自主學(xué)習(xí)及探究行為的影響。將木制立方體箱(50cm×50cm×50cm)內(nèi)壁涂黑，底板劃分成16個小方格，沿墻的12個方格為外周格，其余4個為中央格。實驗中，每次將一只小鼠放在正中央，攝像機記錄3min內(nèi)小鼠在中心格停留時間、運動總路程、穿格次數(shù)、直立次數(shù)和排便粒數(shù)。每只小鼠結(jié)束觀察后用75%的酒精擦拭箱內(nèi)壁以清理其氣味和排泄物，以免影響下次實驗。

1.2.2高架十字迷宮試驗(Elevated plus maze，EPM) 該試驗?zāi)苁箘游锛犬a(chǎn)生探究的沖動也產(chǎn)生恐懼，能較好地反映動物的焦慮情緒。將動物置于迷宮中央，頭朝向封閉臂區(qū)，用攝像器記錄其活動情況。記錄每只實驗小鼠5min內(nèi)的開臂進入次數(shù)(OE)與閉臂進入次數(shù)(CE)，開臂進入時間( open arm time, OT)和閉臂進入時間( close arm time, CT)。開臂次數(shù)百分比(OE%)=開臂次數(shù)/(開閉次數(shù)+閉臂次數(shù))，開臂停留時間百分比(OT%)=開臂停留時間/(開臂停留時間+閉臂停留時間)。

1.4實驗小鼠血清中甘油三酯(T-CHO)和總膽固醇(TG)的含量的測定 實驗動物染毒結(jié)束后，麻醉處理，眼球取血入1.5mL離心管，靜置后離心取血清凍存于-80℃冰箱備用。應(yīng)用ELISA法測定血清中T-CHO、TG的含量(試劑盒來自南京建成生物研究所)。

1.5實驗小鼠皮質(zhì)中氧化損傷指標的檢測 動物染毒結(jié)束后，于冰盒上取皮質(zhì)組織，凍存于-80℃冰箱備用。取皮質(zhì)組織，加裂解液，制作10%的組織勻漿，離心取上清液。①應(yīng)用ELISA法檢測組織中鐵、GSH和MDA含量。ELISA試劑盒來自南京建成生物研究所。②應(yīng)用Wester-Blot進行皮質(zhì)中GPX4和SLC7A11 蛋白表達的檢測：將皮質(zhì)組織以1mg：7.5μL比例加入適量預(yù)冷的RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制劑PMSF)，冰上勻漿，4℃，12000r/min,離心半徑6cm，離心30min，取上清于離心管并置于-20℃保存。以BCA法進行蛋白濃度定量。蛋白變性。SDS聚丙烯酰胺凝膠配制。電泳。轉(zhuǎn)膜。應(yīng)用Image J軟件定量分析條帶光密度值。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒來自Solarbio生命科學(xué)公司，GPX4抗體和SLC7A11抗體來自Affinity生物科技公司。

2 結(jié)果

2.1鉛暴露對肥胖小鼠肥胖指數(shù)和脂肪系數(shù)的影響 與對照組比較，肥胖組和鉛暴露+肥胖組小鼠的肥胖指數(shù)、脂肪系數(shù)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0)。見表1、圖1。

表1 鉛暴露小鼠脂肪系數(shù)和肥胖指數(shù)的變化

圖1 各組小鼠脂肪系數(shù)和肥胖指數(shù)的變化

2.2鉛暴露對肥胖小鼠T-CHO、TG的影響 對照組相比，肥胖組和鉛暴露+肥胖組中小鼠血清中T-CHO、TG含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。未見鉛暴露+肥胖組與肥胖組小鼠血清中T-CHO、TG含量有明顯差異。見表2、圖2。

表2 鉛暴露對肥胖小鼠血清T-CHO、TG的影響

圖2 各組小鼠血清T-CHO、TG的變化

2.3鉛暴露對肥胖小鼠神經(jīng)行為的影響

2.3.1鉛暴露對肥胖小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響 在曠場試驗中，鉛暴露組和鉛暴露+肥胖組小鼠中央?yún)^(qū)域停留時間明顯低于對照組和肥胖組，而鉛暴露+肥胖組小鼠中央?yún)^(qū)域停留時間又顯著高于鉛暴露組；與對照組和肥胖組比較，鉛暴露組和鉛暴露+肥胖組小鼠站立次數(shù)明顯減少，肥胖組小鼠站立次數(shù)高于鉛暴露組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 鉛暴露對肥胖小鼠中央?yún)^(qū)域停留時間和站立次數(shù)的影響

圖3 鉛暴露后肥胖小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化

2.3.2鉛暴露對肥胖小鼠焦慮抑郁癥狀的影響 在高架十字迷宮試驗中，肥胖組、鉛暴露組和鉛暴露+肥胖組小鼠進入開放臂次數(shù)比例均低于對照組，鉛暴露組和鉛暴露+肥胖組小鼠在開放臂停留時間比例均低于對照組和肥胖組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖4。

表4 鉛暴露對肥胖小鼠進入開放臂次數(shù)和時間的影響

圖4 鉛暴露后肥胖小鼠焦慮抑郁狀態(tài)的變化

2.4鉛暴露對肥胖小鼠皮質(zhì)氧化損傷相關(guān)指標的影響

2.4.1鉛暴露對實驗小鼠皮質(zhì)中Fe、GSH和MDA含量的影響 與對照組比較，肥胖組和鉛暴露+肥胖組小鼠皮質(zhì)中Fe和MDA含量均升高，GSH含量降低；與肥胖組比較，鉛暴露+肥胖組小鼠皮質(zhì)中鐵和MDA含量升高，GSH含量降低；與鉛暴露組比較，鉛暴露+肥胖組小鼠皮質(zhì)中MDA和GSH含量均發(fā)生明顯變化，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Fe含量沒有明顯差異。見表5、圖5。

表5 鉛暴露肥胖小鼠皮質(zhì)中Fe、GSH和MDA含量變化

圖5 各組小鼠皮質(zhì)中Fe、GSH和MDA含量變化

2.4.2鉛暴露對實驗小鼠皮質(zhì)中GPX4和SLC7A11蛋白表達的影響 鉛暴露組、肥胖組和鉛暴露+肥胖組相較于對照組，小鼠皮質(zhì)中GPX4和SLC7A11 蛋白表達降低，(P<0.05)。與肥胖組比較，鉛暴露組和鉛暴露+肥胖組小鼠皮質(zhì)中GPX4和SLC7A11 蛋白表達均降低，且鉛暴露+肥胖組小鼠皮質(zhì)中GPX4和SLC7A11 蛋白表達降低更明顯(P<0.05)。見圖6。

圖6 鉛暴露肥胖小鼠皮質(zhì)中GPX4、SLC7A11 表達變化

3 討論

本研究以高脂飲食和醋酸鉛飲水成功建立了鉛暴露肥胖小鼠模型，通過檢測皮質(zhì)鐵含量和GSH抗氧化系統(tǒng)的蛋白變化，初步闡明了鉛暴露對肥胖小鼠皮質(zhì)鐵死亡的影響。神經(jīng)行為試驗結(jié)果表明，鉛暴露加劇了肥胖小鼠的神經(jīng)行為損害，包括學(xué)習(xí)記憶能力和探究能力降低、焦慮抑郁癥狀增加。鉛暴露+肥胖組相較于肥胖組，實驗小鼠皮質(zhì)中Fe和MDA含量升高，GSH含量降低，并且鉛暴露+肥胖組小鼠皮質(zhì)中MDA和GSH含量變化更加明顯，并有加劇趨勢；肥胖組、鉛暴露組、鉛暴露+肥胖組實驗小鼠皮質(zhì)GPX4和SLC7A11 蛋白表達均低于對照組，且鉛暴露組和鉛暴露+肥胖組中小鼠皮質(zhì)中GPX4和SLC7A11 蛋白表達也低于肥胖組，鉛暴露+肥胖組降低更為明顯。鉛暴露肥胖小鼠的焦慮抑郁程度加重，鉛暴露+肥胖組小鼠皮質(zhì)中鐵和MDA含量升高、GSH含量顯著降低，鉛暴露+肥胖組小鼠皮質(zhì)中GPX4和SLC7A11 蛋白表達顯著降低。提示鉛暴露可能加劇肥胖小鼠皮質(zhì)鐵死亡。

長期慢性鉛暴露可導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)憶能力下降、焦慮抑郁等神經(jīng)行為變化，肥胖也與神經(jīng)精神疾病有關(guān)，但是鉛暴露是否加劇肥胖實驗動物神經(jīng)行為改變及其有關(guān)機制的研究較少。本研究對實驗小鼠的神經(jīng)行為進行測試，曠場試驗結(jié)果顯示，肥胖小鼠以及肥胖小鼠鉛暴露后，中央?yún)^(qū)域停留時間及站立次數(shù)降低，提示鉛暴露導(dǎo)致小鼠的學(xué)習(xí)記憶和探究能力下降，與Ho等[8]的報道的一致。高架十字迷宮試驗結(jié)果顯示，小鼠在經(jīng)鉛暴露24周后，開放臂次數(shù)比例及停留時間比例都低于對照組；Louise等將2005～2015年納入瑞典兒童肥胖治療登記冊的12507人(6～17歲)，與其相匹配的對照人群進行比較，發(fā)現(xiàn)肥胖是兒童和青少年焦慮抑郁重要的危險因素，本研究結(jié)果也表明肥胖小鼠的焦慮抑郁狀態(tài)增加，提示鉛暴露可導(dǎo)致實驗小鼠出現(xiàn)焦慮抑郁狀態(tài)，而鉛暴露肥胖小鼠表現(xiàn)出更強烈的焦慮抑郁狀態(tài)。

鐵死亡是一種因鐵離子大量蓄積，伴隨脂質(zhì)過氧化發(fā)生的程序性死亡方式，以 GSH耗竭、鐵離子和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA增加為主要特點，涉及許多分子事件，包括心肺損傷[9]、腫瘤[10]和神經(jīng)退行性疾病[11-12]。本研究對實驗小鼠皮質(zhì)中GSH、Fe和MDA進行測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗小鼠皮質(zhì)中鐵和MDA含量均升高，GSH含量降低。為進一步探究皮質(zhì)鐵死亡的相關(guān)機制，我們檢測了鉛暴露小鼠、肥胖小鼠和鉛暴露肥胖小鼠的皮質(zhì)鐵死亡標志性分子蛋白SLC7A11和GPX4的表達水平，以探討鉛暴露對肥胖小鼠皮質(zhì)鐵死亡的影響。SLC7A11作為胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體( xc-系統(tǒng))中重要組成，調(diào)控胱氨酸在細胞內(nèi)和細胞外之間的轉(zhuǎn)換，而胱氨酸是合成 GSH 的重要的蛋白原料[13]。由于 SLC7A11 蛋白表達受到干擾或抑制可能造成GSH合成不足，從而導(dǎo)致GPX4活性下降，GPX4通過降解某些脂質(zhì)過氧化物，抑制脂質(zhì)過氧化。本研究結(jié)果顯示，肥胖組、鉛暴露組和鉛暴露+肥胖組小鼠皮質(zhì)中GPX4和SLC7A11表達均降低，而肥胖組小鼠在增加鉛暴露后，皮質(zhì)中SLC7A11和 GPX4表達降低更明顯。GPX4 表達降低，導(dǎo)致脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA增加， GSH合成降低。

綜上所述，鉛暴露和肥胖均可引起實驗小鼠的焦慮抑郁癥狀，而鉛暴露可增加肥胖小鼠的焦慮抑郁癥狀，這些可能由于鉛暴露加劇了肥胖小鼠皮質(zhì)鐵死亡。