鐘文富，黃菁雯，曾灝，葉慧芬，毛錦江，羅裕，楊日榮

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣西 南寧 530021；2.貴港市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 貴港 537100； 3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 南寧 530021)

0 引言

耳聾是最常見(jiàn)的出生缺陷之一，新生兒中聽(tīng)力缺陷患兒出生概率約為1/1000[1]。聽(tīng)力障礙給個(gè)人和家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力，是嚴(yán)重影響人口素質(zhì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大疾患。對(duì)孕婦進(jìn)行耳聾基因篩查，必要時(shí)行產(chǎn)前診斷，可以幫助評(píng)估生產(chǎn)聾兒的風(fēng)險(xiǎn)，最終避免出生缺陷的發(fā)生。本研究對(duì)2200名聽(tīng)力正常的孕婦進(jìn)行基因篩查和產(chǎn)后隨訪，了解本地區(qū)耳聾基因突變的攜帶率，并對(duì)高危孕婦行產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢(xún)，及時(shí)阻止耳聾患兒的出生，有效降低出生缺陷的發(fā)生率。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

為了得到箱梁翼緣板的準(zhǔn)確正應(yīng)力，將預(yù)應(yīng)力加在兩腹板上的點(diǎn)10位置處，如圖1所示，兩根鋼束的預(yù)應(yīng)力合力大小均為300 N。在ANSYS中利用LINK8單元模擬預(yù)應(yīng)力作用，通過(guò)賦予初始應(yīng)變得到所需預(yù)應(yīng)力。研究初期，也曾用等效荷載加在同一位置處，提取的結(jié)果和用LINK8單元算出來(lái)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，最后發(fā)現(xiàn)誤差較小，說(shuō)明用LINK8單元模擬縱向預(yù)應(yīng)力筋是準(zhǔn)確的。跨中施加的集中荷載P亦可模擬車(chē)輪荷載作用下在跨中的等效集中力。

選擇2200例聽(tīng)力正常的孕婦為研究對(duì)象，向其進(jìn)行耳聾基因篩查內(nèi)容宣教后，孕婦接受篩查并簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Waters高效液相色譜儀：Waters515二元梯度泵，Waters2487DualλUV檢測(cè)器。0.45 μm微孔濾膜(天津菲羅門(mén))，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮RE-52型)。GA3，IAA和ABA標(biāo)準(zhǔn)樣品均為Fluka公司的HPLC試劑，乙腈和甲醇為色譜級(jí)，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

8點(diǎn)了，營(yíng)業(yè)部里的人陸續(xù)來(lái)上班了，大家都像往常一樣打著招呼，可大家都覺(jué)得彼此的眼神和話(huà)語(yǔ)里好像多了些內(nèi)容，到底是什么內(nèi)容，大家都不好說(shuō)，也不能說(shuō)。

通過(guò)電話(huà)、網(wǎng)絡(luò)等多種途徑對(duì)已分娩孕婦進(jìn)行了隨訪，4例新生兒聽(tīng)力初篩未通過(guò)，42天復(fù)查通過(guò)，尚未發(fā)現(xiàn)先天性耳聾患兒出生。

2200例孕婦中檢查出耳聾基因攜帶者53例，攜帶率為2.41%。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

為了慶祝李家莊整體建成李家社區(qū)，縣電視臺(tái)拍攝了一部《從農(nóng)民到市民的跨躍》的專(zhuān)題片，采訪的第一個(gè)對(duì)象就是我。當(dāng)村支書(shū)李順（對(duì)了，現(xiàn)在叫社區(qū)主任）帶著記者上樓時(shí)，我正癡迷地看著我那個(gè)小魚(yú)塘。

《后漢書(shū)》卷七十八《宦者列傳》張讓傳：“(靈)帝本侯家，宿貧，每嘆桓帝不能作家居，故聚為私藏，復(fù)寄小黃門(mén)常侍錢(qián)各數(shù)千萬(wàn)。常云：‘張常侍是我公，趙常侍是我母?！盵31](第9冊(cè)，P2536)早年的貧窮并不必然導(dǎo)致關(guān)心民生疾苦，反而極有可能導(dǎo)致極端的貪婪。靈帝已是帝王之尊尚且如此，又何怪乎貪腐橫行。正是基于此，我們反思錢(qián)穆所謂“全民政治”，平民進(jìn)入政府是否必然保障政府關(guān)心平民？徐復(fù)觀的反駁顯然極有道理，“陳世美現(xiàn)象”就是最好的證明。一個(gè)人為了自己向上爬可以?huà)伷迼壸樱衷跄苤竿绱酥藶槊裾?qǐng)命呢！

4個(gè)常見(jiàn)耳聾基因中的13個(gè)熱點(diǎn)突變。

1.5 樣本的檢測(cè)

抽取被檢者2mL靜脈血，提取樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物變性、冰水浴后進(jìn)行膜條雜交，經(jīng)過(guò)洗膜封閉膜等操作后顯色觀察結(jié)果。

1.4 檢測(cè)位點(diǎn)

1.6 建議耳聾基因攜帶者的丈夫也進(jìn)行同型基因檢測(cè)，采樣后送至廣州凱普檢驗(yàn)所行Sanger測(cè)序。1.7 對(duì)攜帶同基因型的夫婦提供遺傳咨詢(xún)，在夫婦充分知情同意情況下進(jìn)行產(chǎn)前診斷，經(jīng)超聲介導(dǎo)行羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水，提取羊水細(xì)胞DNA進(jìn)行基因檢測(cè)。

1.8 孕婦生育后，對(duì)新生兒的聽(tīng)力狀態(tài)進(jìn)行追蹤隨訪。

DNA提取試劑盒(廣州凱普)，耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒(廣州凱普)。

2 結(jié)果

2.1 孕婦耳聾基因篩查結(jié)果

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

表1 2200例孕婦耳聾基因突變類(lèi)型及突變率(n=2200)

2.2 配偶基因檢測(cè)結(jié)果

50例攜帶有GJB2或者SLC26A4 基因變異孕婦的丈夫，40例同意行相應(yīng)基因檢測(cè)，其中37例未檢測(cè)出基因變異，3例檢測(cè)出基因變異。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

就目前我國(guó)槍械的性能來(lái)說(shuō),其總體性能與國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品相比確實(shí)具有一定差距。我國(guó)某型號(hào)步槍的綜合性能相當(dāng)于美國(guó)的M16A2、俄羅斯的AK74M。該步槍的機(jī)械系統(tǒng)復(fù)雜,各種原因引起的故障問(wèn)題不可避免。由于步槍多為單人手提武器,伴隨士兵行動(dòng),使用時(shí)多為貼身操作,一旦發(fā)生故障,即有危害人身安全的可能[1-3],因此步槍故障問(wèn)題的研究具有十分重要的意義。

表2 3個(gè)家庭耳聾基因檢測(cè)結(jié)果

2.3 攜帶相同變異基因家庭的妊娠結(jié)局

攜帶相同變異基因家庭經(jīng)過(guò)充分的遺傳咨詢(xún)和知情同意，1號(hào)孕婦接受產(chǎn)前診斷，羊水檢測(cè)結(jié)果為c.235delC純合突變，最終選擇終止妊娠；2號(hào)與3號(hào)夫婦拒絕產(chǎn)前診斷，胎兒足月生產(chǎn)，均通過(guò)聽(tīng)力篩查并做了基因篩查。胎兒基因結(jié)果見(jiàn)表3

表3 3例胎兒基因檢測(cè)結(jié)果

2.4 產(chǎn)后隨訪

核酸提取儀，PCR擴(kuò)增儀，雜交儀，冰盒等。

3 討論

每年新增的耳聾患兒絕大部分出生于聽(tīng)力正常的家庭，目前尚無(wú)有效的治療辦法，對(duì)家庭和社會(huì)產(chǎn)生巨大的壓力。其中影響最大的是先天性耳聾，如果不能在言語(yǔ)發(fā)育前及時(shí)干預(yù)，不僅可能因聾至啞，甚至可能影響其認(rèn)知、智力等的發(fā)育。因此，推廣孕期耳聾基因篩查及對(duì)先天性耳聾早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)，對(duì)降低耳聾出生缺陷和對(duì)改善耳聾患兒生活質(zhì)量意義重大。

夏 季 ：峰 時(shí) 段（8：00-11：00、13：00-15：00，18：00-21：00），平時(shí)段（6：00-8：00、11：00-13：00、15：00-18：00，21：00-22：00），谷時(shí)段（22：00-次日6：00）；峰時(shí)段電價(jià) 1.132 元/kWh，平時(shí)段電價(jià)0.700元/kWh，谷時(shí)段電價(jià)0.264元/kWh。

有調(diào)查發(fā)現(xiàn)超50%的非綜合征型耳聾是因?yàn)镚JB2、GJB3、SLC26A4及線粒體12SrRNA這四個(gè)基因突變引起，其中GJB2基因突變占比最高[2]。目前我國(guó)耳聾基因篩查主要是針對(duì)4個(gè)基因中的9-20個(gè)位點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，篩查9個(gè)位點(diǎn)平均攜帶率為4.3%，篩查20個(gè)位點(diǎn)平均攜帶率為4.7%，隨著檢測(cè)位點(diǎn)的擴(kuò)大，檢出率增加[3]。盡管增加了檢測(cè)位點(diǎn)，但僅提高很有限的檢出率，同時(shí)檢測(cè)成本也隨之增加，因此各地區(qū)因根據(jù)自身流調(diào)依據(jù)，找出本地區(qū)突變率高的位點(diǎn)，選擇適合本地區(qū)的篩查方案，節(jié)約檢測(cè)成本的同時(shí)也提高檢出率。本調(diào)查受檢孕婦接受了4個(gè)基因13個(gè)位點(diǎn)的篩查，只檢出53例，四個(gè)耳聾基因中的7種突變位點(diǎn)，攜帶率排在前3位的熱點(diǎn)突變依次為235delC、IVS7-2A＞G、1229C＞T，本研究結(jié)果符合此前235delC為國(guó)內(nèi)最常見(jiàn)基因突變的結(jié)論[4]。本次研究貴港地區(qū)耳聾基因攜帶率為2.41%，低于張昊晴等的報(bào)道[5]，考慮的原因有：(1)研究數(shù)量較少，抽樣誤差所致；檢測(cè)位點(diǎn)偏少，或者檢測(cè)的位點(diǎn)并非本地區(qū)熱點(diǎn)；(2)檢測(cè)方法學(xué)限制，相比二代測(cè)序，測(cè)序方法能檢測(cè)到少見(jiàn)、新發(fā)突變或者臨床意義不明確的突變；(3)耳聾基因具有較高的遺傳異質(zhì)性，不同地區(qū)、不同民族有各自的特點(diǎn)[6]。因此，后續(xù)需增加研究樣本量，找出本地區(qū)覆蓋率高的耳聾基因突變位點(diǎn)， 制定更適合本地的篩查方案服務(wù)臨床。

GJB2突變后可導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾，患者多為先天性耳聾，發(fā)病時(shí)間早，臨床表現(xiàn)嚴(yán)重，以235delC突變最常見(jiàn)。本研究一孕婦產(chǎn)前診斷羊水結(jié)果為GJB2 235delC純合子突變，純合子突變臨床表現(xiàn)為出生后即有重度甚至極重度耳聾，經(jīng)充分考慮家屬要求終止妊娠，避免了先天性聾兒的出生。

隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大量未知的突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，因缺乏臨床數(shù)據(jù)的支持，許多臨床意義不明確的變異位點(diǎn)給臨床遺傳咨詢(xún)帶來(lái)了巨大的困擾。本研究中丈夫的 GJB2 基因測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)2例c.109G＞A突變，近年研究發(fā)現(xiàn) c.109G＞A 普遍存在于亞洲人群中，且該變異位點(diǎn)的致病性存在很大分歧[7]，主要是c.109G＞A純合子或者復(fù)合其他突變?cè)谂R床表現(xiàn)差異性極大，這給遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷的工作開(kāi)展帶來(lái)了困惑。本研究中，經(jīng)遺傳咨詢(xún)告知夫婦c.109G＞A位點(diǎn)變異的臨床表現(xiàn)差異性很大，充分考慮后拒絕產(chǎn)前診斷，胎兒足月出生且通過(guò)聽(tīng)力篩查。其中一例新生兒基因型為c.109G＞A/c.235delA復(fù)合雜合變異，后期這類(lèi)攜帶者的臨床表現(xiàn)并不清楚，定期的聽(tīng)力檢測(cè)及長(zhǎng)期的追蹤隨訪，對(duì)明確c.109G＞A/c.235delA復(fù)合雜合變異的致病性有重要意義。針對(duì)這類(lèi)攜帶者的遺傳咨詢(xún)需小心謹(jǐn)慎，明確告知該基因型的遺傳表型多樣化，并讓家屬充分知情選擇是否進(jìn)行產(chǎn)前診斷及胎兒抉擇。

SLC26A4 基因變異可導(dǎo)致后天中度以上感音神經(jīng)性耳聾，多為語(yǔ)后聾[8]，也俗稱(chēng)“一巴掌打聾”?；純撼錾鷷r(shí)大部分聽(tīng)力正常，多在1歲后逐漸出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)為聽(tīng)力逐漸下降，因此必須在患兒聽(tīng)力損失不重的時(shí)候及早發(fā)現(xiàn)并積極干預(yù)，及早驗(yàn)配助聽(tīng)器；并對(duì)患者家屬進(jìn)行看護(hù)指導(dǎo)，避免劇烈活動(dòng)及頭部撞擊引起耳道破裂造成遲發(fā)性耳聾。少部分成年后由于頭部受到碰撞、打擊等刺激后出現(xiàn)聽(tīng)力減退甚至進(jìn)展為耳聾，具有表型差異性，容易被忽略。因此，通過(guò)篩查及早發(fā)現(xiàn)高危人群，并加強(qiáng)對(duì)高危人群的管理和宣教，能有效避免后天性遺傳性耳聾發(fā)生和發(fā)展。本研究SLC26A4 基因的檢出率是僅次于 GJB2 基因，本地區(qū)攜帶率為 1.09%，最常見(jiàn)突變位點(diǎn)有兩個(gè)，即IVS7-2A＞G和1229C＞T，與大規(guī)模流調(diào)的結(jié)果有差異[9]，可能原因是SLC26A4基因突變位點(diǎn)存在明顯的地域差異。

線粒體12SrRNA基因突變會(huì)導(dǎo)致藥物性耳聾，表現(xiàn)為母系遺傳[10]。線粒體12SrRNA基因突變位點(diǎn)以1555A＞G最常見(jiàn)，一旦誤用氨基糖苷類(lèi)抗生素，將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙，即使少量的氨基糖苷類(lèi)抗生素也可能導(dǎo)致不可逆的聽(tīng)力損傷。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)2例孕婦為藥物性耳聾基因攜帶者，占0.09%，較耿國(guó)興等報(bào)道[11]的比率偏低。當(dāng)前，藥物性耳聾尚無(wú)有效的治療措施，通過(guò)篩查及時(shí)發(fā)現(xiàn)攜帶者，對(duì)該基因攜帶者及其母系家族成員提供遺傳咨詢(xún)及相關(guān)用藥的指導(dǎo)，能有效避免因誤用藥物導(dǎo)致耳聾的悲劇發(fā)生。

GJB3基因是夏家輝院士定位并克隆的第一個(gè)本土基因，與進(jìn)行性高頻耳聾相關(guān)。GJB3基因c.537C＞T位點(diǎn)變異的致病性爭(zhēng)議較大[12]，因此很多遺傳咨詢(xún)專(zhuān)家不建議對(duì)該基因進(jìn)行產(chǎn)前診斷。本研究中僅檢出 1例 GJB3 c.538C＞T 變異位點(diǎn)攜帶者，自述無(wú)耳聾家族史且目前聽(tīng)力正常。GJB3 基因突變?cè)谖覈?guó)人群中發(fā)病率普遍不高，本地區(qū) GJB3 基因攜帶率也僅為0.045%。針對(duì)目前GJB3基因突變的致病性尚存異議，遺傳咨詢(xún)醫(yī)生需結(jié)合臨床表現(xiàn)，謹(jǐn)慎給出對(duì)于 GJB3 c.538C＞T的遺傳咨詢(xún)，并通過(guò)長(zhǎng)期隨訪其聽(tīng)力進(jìn)展來(lái)增加臨床數(shù)據(jù)。

她處于極度的絕望，坐在風(fēng)雪中，仰望天空，雪在空中凝固了，風(fēng)在空中凝固了，一切在這一刻都停止了呼吸，就連高高的煙囪上面飄散出來(lái)的濃煙和熱氣，這一刻也定格成一種僵硬的造型。

本實(shí)驗(yàn)采用PCR+導(dǎo)流雜交方法僅對(duì)常見(jiàn)的4種基因13個(gè)位點(diǎn)的耳聾基因進(jìn)行篩查，不可避免會(huì)漏檢部分突變位點(diǎn)，這是本研究的局限性。二代測(cè)序技術(shù)的研發(fā)應(yīng)用，將成為極具潛力的耳聾基因篩查和診斷工具，其高通量的性能非常適合大規(guī)模人群的普篩及流行病學(xué)的調(diào)查[13]，對(duì)耳聾出生缺陷的防治意義非凡，但鑒于測(cè)序成本高，儀器設(shè)備昂貴，目前臨床推廣難度較大。

本研究對(duì)孕期女性進(jìn)行常見(jiàn)耳聾基因篩查，同時(shí)對(duì)攜帶者的丈夫進(jìn)行基因測(cè)序，針對(duì)高危孕婦行產(chǎn)前診斷可有效避免聾兒的出生，實(shí)現(xiàn)耳聾出生缺陷的二級(jí)防控[14-15]。高攜帶率是我國(guó)耳聾殘疾高發(fā)的根本原因，因此，建議把耳聾基因篩查納入婚檢、產(chǎn)檢及新生兒聽(tīng)力篩查項(xiàng)目，早發(fā)現(xiàn)早干預(yù)，從根本上阻斷致病基因的傳遞，降低耳聾出生缺陷的發(fā)生。