王宏鋒 張翠蓮 谷保霞 王倩 孫瑩璞

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是以稀發(fā)性排卵或者無排卵、高雄激素血癥或胰島素抵抗、多囊卵巢為特征的內(nèi)分泌紊亂的癥候群［1］。PCOS 是引起育齡女性無排卵性不孕的最常見病因，嚴重影響著患者的生育狀況、生命質(zhì)量和遠期健康［2］。據(jù)統(tǒng)計，PCOS 的全球發(fā)病率約為6%～10%，呈現(xiàn)逐年升高的趨勢［3］。PCOS病因和臨床表現(xiàn)的高度異質(zhì)性導致其臨床診斷和治療方案仍存在諸多爭議［4］。外泌體是細胞之間物質(zhì)與信息交換的載體，在機體的多種病理生理學過程中均扮演著重要的角色［5］。從血漿外泌體角度去研究PCOS 相關的差異蛋白質(zhì)組，未見相關報道。因此，本研究擬通過Label?free 定量蛋白質(zhì)組學技術對PCOS 患者的血漿外泌體差異蛋白進行分析，為深入研究PCOS 的發(fā)病機制提供實驗數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

抽取2017年7月至2018年6月于河南省人民醫(yī)院就診的60 例PCOS 患者空腹血漿（PCOS 組）及60 名無PCOS 的健康體檢女性空腹血漿（對照組），每例1 mL。每組隨機抽取血漿標本各3 例，用于Label?free 蛋白質(zhì)組學實驗。每組隨機抽取血漿標本30 例，用于ELISA 驗證實驗。參與本實驗的PCOS 患者均為首次確診病人，且未接受過藥物治療。PCOS 納入標準：2003年歐洲人類生殖及胚胎協(xié)會和美國生殖醫(yī)學學會制定的多囊卵巢綜合征診斷的鹿特丹標準［6］。PCOS 排除標準：①如果泌乳素水平明顯升高應排除垂體瘤；②高雄激素血癥或明顯的高雄激素臨床表現(xiàn)，應排除非典型腎上腺皮質(zhì)增生、柯興氏綜合征、分泌雄激素的卵巢腫瘤等。本研究經(jīng)院醫(yī)學倫理學委員會審核及授權，受試者均簽署實驗知情同意書。

1.2 主要實驗儀器及試劑耗材

Optima L?100XP 低溫超速離心機購自美國的Beckman Coulter 公司；H?7650 透射電鏡購自日本的Hitachi 公司；EASY?nLC 1200 納升級液相色譜儀和Q?Exactive 質(zhì)譜儀購自美國Thermo Scientific公司。質(zhì)譜級牛胰蛋白酶（批號：90059）和常用化學試劑購自美國Thermo Scientific 公司；Sep?Pak 脫鹽柱（批號：WAT020515）購自美國Waters 公司；CD9 抗體（批號：sc?18869AC）、CD63 抗體（批號：sc?15363）和二抗均購自于美國Santa Cruz 公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號：23225）和肽段定量試劑盒（批號：23275）、人MBL2 ELISA 試劑盒（批號：EHMBL2）購自美國Thermo Scientific 公司；人PZP ELISA 試劑盒（批號：XY?PZP?Hu）購自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 血漿外泌體的提取與鑒定

采用超速離心法提取和富集血漿外泌體［7］。利用透射電鏡檢測提取的血漿外泌體囊泡的形狀和直徑。利用Western blot 檢測血漿外泌體標本中特異性標志物蛋白CD9 和CD63 的表達情況。

1.4 血漿外泌體蛋白的裂解

樣品與蛋白裂解液（8 M 尿素，1 μg/mL 抑肽素，5 μg/mL 亮抑蛋白酶肽和1 mM PMSF）按照體積比1∶10 加入；冰水混合物中超聲破碎2 min；冰上蛋白裂解30 min；將裂解產(chǎn)物4℃，12 000 g 離心30 min（離心半徑為6 cm），吸取蛋白上清。

1.5 血漿外泌體蛋白的酶解、肽段純化及定量

吸取150 μg 血漿外泌體蛋白至酶解管，補充蛋白裂解液至150 μL；加入還原劑TCEP 至終濃度10 mM，37℃水浴反應60 min；加入碘乙酰胺儲液至終濃度40 mM，室溫下避光反應40 min；加入7倍體積的100 mM TEAB 緩沖液；按照酶與蛋白比例為1∶50 的質(zhì)量比加入質(zhì)譜級牛胰蛋白酶，37℃水浴16 h。利用Sep?Pak 純化色譜柱純化酶解肽段。利用肽段定量試劑盒對純化后的肽段進行定量。

1.6 Label?free 蛋白質(zhì)組學檢測

調(diào)整肽段濃度為0.5 μg/μL，進行液相色譜?質(zhì)譜分析。數(shù)據(jù)采集軟件為Thermo Xcalibur 4.0；色譜柱為C18 反相色譜柱（75 μm×25 cm）；色譜總分離時間為180 min；緩沖液A 是2%乙腈，0.1%甲酸；緩沖液B 是80% 乙腈，0.1% 甲酸；流動相流速為300 nL/min；MS 掃描質(zhì)荷比（m/z）范圍為350～1 300；采集模式選擇DDA 模式；選擇母離子肽段信號中前20 位肽段進行二級質(zhì)譜分析；一級質(zhì)譜分辨率為70 000；碎裂方式采用HCD 方式；二級質(zhì)譜分辨率為17 500；質(zhì)譜動態(tài)排除時間為30 s。差異蛋白篩選的比率（fold change，F(xiàn)C）標準為：FC＞2.0 或者FC＜-2.0，且P＜0.05。

1.7 生物信息學分析和ELISA

利用DAVID 在線數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析。利用STRING 在線數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行蛋白質(zhì)相互作用分析。選取可能具有相互作用的差異蛋白進行ELISA 驗證，實驗步驟參考ELISA 試劑盒說明書。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學分析；計量資料以（）描述，采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血漿外泌體的鑒定

透射電鏡顯示，提取的血漿外泌體直徑分布范圍為30～150 nm，純度比較高，見圖1A。Western blot 結果表明，CD9 與CD63 條帶呈現(xiàn)富集趨勢，見圖1B。

2.2 血漿外泌體的差異蛋白質(zhì)組學分析

篩選出16個PCOS相關的血漿外泌體差異蛋白，包括4個表達上調(diào)和12個表達下調(diào)的蛋白。見表1。

表1 PCOS 相關血漿外泌體差異蛋白質(zhì)Table 1 Differential expressed proteins of plasma exosomes related to PCOS

2.3 差異蛋白點的生物信息學分析

差異蛋白的GO 富集分析顯示，如果按照參與的生物學過程聚類，其主要集中在細菌防御反應、補體激活的經(jīng)典途徑、B 細胞激活的正向調(diào)控等；如果按照細胞組分聚類，其主要富集在細胞外區(qū)域、細胞外空間、循環(huán)的免疫球蛋白復合體等；如果按照分子功能聚類，其主要富集在免疫球蛋白受體結合活性、抗原結合功能、蛋白酶結合活性，見圖2A。對差異蛋白進行STRING 蛋白質(zhì)相互作用分析發(fā)現(xiàn)，PZP/MBL2/CHFR1/HP 可能存在直接的相互作用，見圖2B。KEGG 通路分析結果顯示，差異蛋白主要富集在補體和凝血級聯(lián)反應信號通路。見圖3。

圖2 PCOS 血漿外泌體差異蛋白的生物信息學分析Figure 2 Bioinformatic analysis of changed proteins in plasma exosomes of PCOS

圖3 PCOS 血漿外泌體差異蛋白的KEGG 通路分析Figure 3 KEGG pathway analysis of changed proteins in plasma exosomes of PCOS patients

2.4 ELISA 驗證

選取妊娠帶蛋白（pregnancy zone protein，PZP）和甘露糖結合凝集素2（mannose binding lec?tin 2，MBL2）進行ELISA 驗證，結果顯示，PCOS 組血漿外泌體中PZP 蛋白濃度（370.9±123.5 ng/mL）高于對照組（128.2±29.9 ng/mL），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4A。 PCOS 組血漿外泌體中MBL2 蛋白濃度（8.4±6.1 ng/mL）低于對照組（16.5±3.3 ng/mL），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4B。

圖4 PZP 和MBL2 的ELISA 實驗驗證Figure 4 ELISA experimental validation of PZP and MBL2

3 討論

國內(nèi)外學者對PCOS 的蛋白質(zhì)組學研究，多采用卵巢組織或者血漿作為研究標本。以卵巢組織作為研究對象可以反映PCOS 的組織學變化，但是無法發(fā)現(xiàn)疾病早期的預警性標記物；以血漿作為研究標本，雖然采集方便、無創(chuàng)傷性，但是最大的缺點是血漿高豐度蛋白對低豐度蛋白的干擾較大［8］。PCOS 發(fā)病過程中伴隨著大量分泌蛋白譜的變化，因此，本研究從血漿外泌體角度去探索PCOS發(fā)病機制相關的差異蛋白質(zhì)組，蛋白譜相對簡單，有利于篩選PCOS 發(fā)病相關的功能性蛋白質(zhì)。

差異蛋白的GO 富集聚類分析表明，其主要參與了細菌防御反應、經(jīng)典的補體激活途徑、B 細胞激活的正向調(diào)控等生物學過程，推測差異蛋白可能參與了機體對PCOS 的免疫調(diào)控過程和代償性應激反應［9］。差異蛋白的細胞組分聚類分析顯示，其主要富集在細胞外區(qū)域、細胞外空間、循環(huán)的免疫球蛋白復合體等，預測結果也反映了本研究所用的血漿外泌體提取方法是成功的。差異蛋白的分子功能聚類分析表明，其主要富集在免疫球蛋白受體結合活性、抗原結合功能、蛋白酶結合活性等，免疫球蛋白結合活性及抗原結合活性主要與機體的免疫調(diào)控過程相關，蛋白酶結合活性可以抑制蛋白酶對機體某些蛋白的降解，推測PCOS 的發(fā)病機制可能與機體的免疫功能紊亂密切相關，與國內(nèi)外的相關研究報道一致［10］。KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要富集在補體和凝血級聯(lián)反應信號通路，從另一個側面反映了機體免疫調(diào)控通路在PCOS 發(fā)病過程中的重要性。

針對PCOS 差異蛋白的STRING 相互作用分析發(fā)現(xiàn)，PZP/MBL2/CHFR1/HP 可能以蛋白質(zhì)復合體的形式參與PCOS 的發(fā)生發(fā)展。因此，后續(xù)的ELISA 驗證實驗選取了PZP 和MBL2 進行蛋白表達量驗證。PZP 是一種免疫抑制蛋白，在胎盤和免疫細胞中均有表達。有研究報道，PZP 在阿爾茨海默病人的血清中表達升高［11］，在支氣管擴張患者的痰液中也表達上調(diào)［12］，另外，在炎癥性腸病的血清外泌體中也檢測到PZP 蛋白的增高，可作為炎癥性腸病診斷的標記物［13］。本研究的蛋白質(zhì)組學和ELISA 實驗結果，均發(fā)現(xiàn)PZP 在PCOS 的血漿外泌體中表達上調(diào)，提示PZP 可能作為免疫抑制蛋白參與了PCOS 的發(fā)病過程。MBL2 是一種存在于血清中的C 型凝集素，主要是通過結合病原生物表面的甘露糖等糖基受體發(fā)揮調(diào)理吞噬作用，或者通過MBL 途徑激活補體，在機體的固有免疫應答過程中發(fā)揮重要功能［14］。MBL2 基因突變與感染性疾病、自身免疫性疾病、腎臟疾病均有一定的相關性［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，MBL2 在PCOS 的血漿外泌體中表達下調(diào)，與定量蛋白質(zhì)組學的實驗結果趨勢一致，推測MBL2 可能通過減少MBL途徑的補體激活進而抑制機體的免疫水平，促進PCOS 的病理生理學進展。

綜上所述，本研究通過非標記定量蛋白質(zhì)組學方法篩選出與PCOS 發(fā)病相關的差異蛋白質(zhì)，PZP 和MBL2 有希望成為未來研究PCOS 發(fā)病機制的新靶點，但是需要針對性地設計后續(xù)的功能學實驗進行深入的研究。