曲守方 李麗莉 張文新 孫楠 黃傳峰 黃杰

染色體微缺失/微重復(fù)綜合征是一類常見的染色體病，由一段染色體的缺失或重復(fù)所造成。研究報道的染色體微缺失/微重復(fù)綜合征達到300 多種，包括天使綜合征（Angelman syndrome，AS）、普拉德?威利綜合征（Prader?Willi syndrome，PWS）、貓叫綜合征（Cri duChat syndrome）、迪格奧爾格綜合征（DiGeorge syndrome，DGS）、史密斯?馬吉利綜合（Smith?Magenis syndrome）、威廉姆斯綜合征（Williams?Beuren syndrome，WBS）、4 號染色體短臂末端亞端粒缺失綜合征（Wolf?Hirschhorn syn?drome）等［1?3］。染色體微缺失/微重復(fù)綜合征由于染色體缺失片段或者重復(fù)片段較為微小，通常被產(chǎn)前診斷漏檢，導(dǎo)致新生兒出生缺陷，出現(xiàn)先天性心臟病、泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育異常、免疫缺陷、發(fā)育遲滯和認知障礙等各種臨床表型［4?5］。產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷能夠避免產(chǎn)生遺傳缺陷患兒，從而減輕患兒的家庭負擔(dān)，具有重要的臨床意義。

染色體微缺失/微重復(fù)綜合征的檢測技術(shù)包括熒光原位雜交技術(shù)法（fluorescence in situ hybrid?ization，F(xiàn)ISH）、熒光定量PCR（realtime fluores?cence quantitative PCR，RTFQ PCR）、多重鏈接探針法（multiplex ligation?dependent probe amplifica?tion，MLPA）、染色體微陣列分析（chromosomal mi?croarray，CMA）和高通量測序技術(shù)（high through?put sequencing technology）等。目前國內(nèi)多家公司開發(fā)了基于高通量測序技術(shù)的染色體拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，用于檢測染色體微缺失綜合征。本研究評價基于高通量測序技術(shù)的染色體微缺失檢測的準(zhǔn)確性，為該類試劑盒的性能評價提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

染色體拷貝數(shù)變異檢測國家參考品，批號：360024?201801，中國食品藥品檢定研究院提供。其中染色體微缺失樣本，包括DiGeorge 綜合征、Prader?Willi/Angelman 綜合征和Williams?Beuren 綜合征。

1.2 主要試劑

染色體拷貝數(shù)變異檢測試劑盒（可逆末端終止測序法）、高通量測序文庫構(gòu)建DNA 純化試劑盒（磁珠法）和測序反應(yīng)通用試劑盒（測序法），購自杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司；KAPA Library Quantification Kits 定量試劑盒，購自美國KAPA BIOSYSTEMS 公司。

染色體非整倍體和拷貝數(shù)變異檢測試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測序法）和測序反應(yīng)通用試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測序法），購自華大生物科技（武漢）有限公司；ExKubit dsDNA HS Assay Kit，購自依科賽生物科技（太倉）有限公司；QubitTMssDNA Assay Kit，購自美國INVITROGEN 公司。

染色體拷貝數(shù)變異檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）和測序反應(yīng)通用試劑盒（半導(dǎo)體法），購自東莞博奧木華基因科技有限公司。

1.3 主要儀器

T100 Thermal Cycler 基因擴增儀，購自美國BIO?RAD 公司；QuantiStudio 3 實時熒光定量PCR儀，購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；NextSeq CN500基因測序儀，購自杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司。

ABI 9700 PCR 儀和Qubit 熒光定量儀4.0，購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；BGISEQ?500 基因測序儀，購自華大生物科技（武漢）有限公司。

ABI 9902 基因擴增儀和ABI7500 熒光定量PCR儀，購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；BioelectronSeq 4000基因測序儀，購自博奧木華基因科技有限公司。

1.4 方法

使用T100 Thermal Cycler 基因擴增儀進行染色體微缺失DNA 片段化、酶滅活、末端補平和接頭連接等步驟，構(gòu)建文庫。使用高通量測序文庫構(gòu)建DNA 純化試劑盒（磁珠法）進行文庫純化。純化后的文庫用QuantStudio 3 實時熒光定量PCR儀和KAPA Library Quantification Kits 進行濃度測定。按照等摩爾量混樣規(guī)則進行檢測文庫混樣。使用基因測序儀（NextSeq CN500）和測序反應(yīng)通用試劑盒進行（測序法）測序。

使用ABI 9700 PCR 儀進行染色體微缺失DNA打斷修復(fù)、接頭連接和PCR 擴增等步驟，獲得文庫。使用ExKubit dsDNA HS Assay Kit 和Qubit 熒光定量儀4.0 對純化的文庫進行濃度測定。使用測序反應(yīng)通用試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測序法）進行環(huán)化反應(yīng)。使用QubitTMssDNA Assay Kit 和Qubit 熒光定量儀4.0 對DNA 納米球（DNA nanoball，DNB）產(chǎn)物進行濃度測定，然后將DNB 產(chǎn)物加載到芯片。使用基因測序儀（BGISEQ?500）進行測序。

使用試劑盒的核酸內(nèi)切酶將基因組DNA 隨機打斷；使用ABI9902 基因擴增儀進行接頭連接和擴增富集后獲得DNA 文庫。使用ABI7500 熒光定量PCR 儀和試劑盒定量標(biāo)準(zhǔn)品對文庫定量，然后進行文庫混合。使用BioelectronSeq 4000 基因測序儀和測序反應(yīng)通用試劑盒（半導(dǎo)體法）進行測序。

對樣本DNA 進行低深度全基因組測序，采用試劑盒配套的染色體拷貝數(shù)變異檢測軟件對獲得的測序數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)分析。將各條染色體上不同窗口對應(yīng)的拷貝率和全基因組范圍內(nèi)的檢驗統(tǒng)計值與正常樣本的檢驗統(tǒng)計值比較找出變異區(qū)域，再根據(jù)變異區(qū)域的位置信息和長度判定樣本拷貝數(shù)變異情況。

2 結(jié)果

對試劑盒范圍內(nèi)的國家參考品中染色體微缺失樣本進行檢測，不同測序儀平臺的染色體拷貝數(shù)檢測試劑盒的結(jié)果顯示均檢出標(biāo)注的染色體拷貝數(shù)變異（Copy number variations，CNV），而且試劑結(jié)果和對照方法CNV 結(jié)果的交疊區(qū)域（overlap）均在對照方法的變異區(qū)域的80%～100%范圍內(nèi)，見表1。國家參考品中DiGeorge 綜合征樣本的結(jié)果顯示不同試劑盒均能檢測到22q11.2 區(qū)域缺失，試劑盒A 的拷貝數(shù)檢測值（Sample Copy Number，SCN）是0.984，試劑盒B 的檢測值（Copy Ratio）是0.524，試劑盒C 的拷貝數(shù)是1.06，見表1 和圖1。國家參考品中Williams?Beuren 綜合征樣本的結(jié)果顯示不同試劑盒均能檢測到7q11.23 區(qū)域缺失并覆蓋關(guān)鍵基因ELN 的位置（chr7：73442503?73484236），試劑盒A 的SCN 是1.040，試劑盒B 的Copy Ratio 是0.543，試劑盒C 的拷貝數(shù)是0.93。見表1 和圖2。

表1 染色體微缺失準(zhǔn)確性結(jié)果Table 1 Results of accuracy for chromosome microdeletion

圖1 不同試劑盒DiGeorge 綜合征樣本的檢測結(jié)果Figure 1 Results of DiGeorge syndrome by detection kits

圖2 不同試劑盒Williams?Beuren 綜合征樣本的檢測結(jié)果Figure 2 Results of Williams?Beuren syndrome by detection kits

3 討論

由致病性基因組拷貝數(shù)變異導(dǎo)致的染色體微缺失/微重復(fù)綜合征是胎兒出生缺陷的重要遺傳學(xué)病因。研究報道多重鏈接探針法和染色體微陣列分析法等技術(shù)方法可以聯(lián)合應(yīng)用核型分析技術(shù)提高染色體異常的檢出率［6?8］。傳統(tǒng)核型分析雖然是染色體疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是具有操作復(fù)雜、對羊水細胞培養(yǎng)失敗率高和無法檢出5 Mb 以下的拷貝數(shù)變異的局限性。而高通量測序技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、測序通量大、靈敏度高和檢測成本低等優(yōu)勢，已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用于染色體拷貝數(shù)變異檢測［9?10］。

DiGeorge 綜合征作為一種染色體22q11.2 微缺失綜合征，是22q11.2 區(qū)域內(nèi)3 Mb 基因缺失引起的高異質(zhì)性臨床綜合征。Williams?Beuren 綜合征是染色體7q11.23 區(qū)域內(nèi)1.5～1.8 Mb 基因雜合缺失引起［11］，ELN基因是關(guān)鍵基因，位置在chr7：73442503?73484236，與重復(fù)序列區(qū)域沒有重疊，該綜合征的臨床解讀原則為檢測到7q11.23 區(qū)域缺失并完全覆蓋關(guān)鍵基因。普拉德?威利綜合征是父源染色體15q11.2?q13 近著絲粒區(qū)域印記基因缺陷引起的神經(jīng)發(fā)育性疾?。?2］。天使綜合征是母源染色體15q11.2?q13 染色體區(qū)域的UBE3A基因表達異?；蚬δ苋毕菀鸬纳窠?jīng)發(fā)育障礙性疾病。雖然國內(nèi)外不同的研究報道了染色體微缺失/微重復(fù)綜合征的重要基因和核心區(qū)域，但是這些區(qū)域并不一致。為了滿足臨床檢測的需要，不同公司設(shè)計開發(fā)的試劑盒對染色體微缺失/微重復(fù)區(qū)域的準(zhǔn)確性檢測是非常必要的。影響檢測準(zhǔn)確性的因素主要包括以下幾個方面：樣本有效數(shù)據(jù)量，變異區(qū)域的大小以及變異區(qū)域的位置等。開發(fā)的試劑盒對染色體微缺失/微重復(fù)的檢測原理均是低深度全基因組測序，測序深度約為0.3×。在有效數(shù)據(jù)量達到質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的條件下，變異區(qū)域越大，所包含的測序窗口越多，納入統(tǒng)計的數(shù)據(jù)也越多，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度越高。低深度全基因組測序會導(dǎo)致部分基因組區(qū)域沒有覆蓋，而且覆蓋的區(qū)域也會有所不同，導(dǎo)致片段的斷裂點出現(xiàn)隨機誤差。另外如果變異區(qū)域處于端粒位置或高度重復(fù)區(qū)域，也會影響檢測變異區(qū)域位置的準(zhǔn)確性［13?14］。

中國食品藥品檢定研究院研制的染色體拷貝數(shù)變異檢測國家參考品，包括Jacobsen 綜合征、Cri duChat 綜合征、DiGeorge 綜合征、Prader?Willi/Angelman 綜合征、Smith?Magenis 綜合征、Wil?liams?Beuren 綜合征和Wolf?Hirschhorn 綜合征等染色體微缺失微重復(fù)綜合征樣本。本研究使用不同測序平臺的染色體拷貝數(shù)變異檢測試劑盒，包括可逆末端終止測序法、聯(lián)合探針錨定聚合測序法和半導(dǎo)體測序法，對染色體拷貝數(shù)變異國家參考品［15］的染色體微缺失綜合征樣本進行檢測，選取了三種試劑盒共同檢測范圍內(nèi)的綜合征樣本進行準(zhǔn)確性評價。研究結(jié)果表明三種試劑盒均能檢出相應(yīng)的染色體拷貝數(shù)變異的位置，而且試劑結(jié)果和對照方法結(jié)果的交疊區(qū)域均在對照方法的變異區(qū)域的80%～100%范圍內(nèi)，能夠滿足國家參考品準(zhǔn)確性的要求，表明試劑盒的染色體微缺失檢測的準(zhǔn)確性較好。在評價染色體拷貝數(shù)變異檢測試劑盒準(zhǔn)確性的性能時，不僅要求試劑盒能夠檢測出樣本的染色體拷貝數(shù)變異類型，而且檢測的變異區(qū)域要準(zhǔn)確，才能為臨床檢測的需要提供有力的技術(shù)支持。