吳景 李曉潔 何杰

胃癌是常見惡性腫瘤之一，其發(fā)生與遺傳、環(huán)境、飲食、生物及免疫功能等因素相關(guān)。EB 病毒（Epstein?Barr virus，EBV）是一種人皰疹病毒，主要感染B 細(xì)胞、上皮細(xì)胞，也會感染T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞。EBV 感染與許多腫瘤及非腫瘤性疾病關(guān)系密切，已證實與鼻咽癌、EBV 感染相關(guān)的淋巴瘤、淋巴組織增生性疾病以及胃癌有關(guān)。EBV 編碼的小RNA（Epstein?Barr encoded RNAs，EBER）以高拷貝數(shù)存在于EBV 感染的細(xì)胞核中，Tokuna?ga M 等［1］在1993年提出應(yīng)用原位雜交檢測EBER證實胃癌EBV 感染。本文通過回顧性分析胃癌組織中EBER 的表達(dá)情況，探索其與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集安徽省腫瘤醫(yī)院2018年6月至2019年5月胃癌根治性手術(shù)切除樣本127 例，均為10%中性福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋。男性患者93 例，女性患者34 例，年齡范圍31 至85 歲，中位年齡65歲，入選的患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療等抗腫瘤治療。

1.2 主要試劑

EBER 探針、原位雜交消化酶、藍(lán)染檢測試劑盒、紅色復(fù)染液、各清洗緩沖液、脫蠟液、液體封蓋膜、細(xì)胞處理液均購自美國羅氏公司。

1.3 方法

腫瘤組織石蠟包埋后3 μm 厚度切片，60℃恒溫箱烤片2 h，Ventana BenchMark XT 全自動染色儀進(jìn)行全自動原位雜交檢測。檢測過程：組織脫蠟后經(jīng)熱修復(fù)及酶消化，熒光素標(biāo)記的探針與組織中特異的靶序列進(jìn)行雜交，加入帶生物素的二抗與鏈酶親合素?堿性磷酸酶混合物結(jié)合，底物經(jīng)顯色后產(chǎn)生藍(lán)色沉淀物。用已知陽性組織作為陽性外對照。根據(jù)2016年美國癌癥聯(lián)合委員會/國際抗癌聯(lián)盟（American Joint Committe on Cancer/Union for International Cancer Control，AJCC/UICC）胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（第八版）［2］對所有患者進(jìn)行病理分期。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗及Fisher 精確檢驗法進(jìn)行組間比較。P＜0.05 示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBER 在胃癌組織中的表達(dá)

EBER 定位于細(xì)胞核，表現(xiàn)為藍(lán)色信號，呈彌漫性或散在的點狀染色，與紅色襯染的背景形成鮮明對比。127 例胃癌中13 例EBER 陽性，陽性率10.2%。除表達(dá)于腫瘤組織區(qū)域，EBER 也可見于鄰近腫瘤的異型增生組織中，間質(zhì)往往伴有多量淋巴細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 EBER 在胃癌中的表達(dá)（×100）Figure 1 Expression of EBER in gastric cancer（×100）

2.2 EBER 與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

不同的lauren 分型之間EBER 陽性率存在差異（χ2=6.290，P＜0.05），在混合性中感染率最高。不同性別、年齡、腫塊部位、腫塊直徑、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)之間的EBER 陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 EBER 與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性［n（%）］Table 1 Correlation between EBER and clinicopathological features in patients with gastric cancer［n（%）］

3 討論

EBV 進(jìn)入人體在歷經(jīng)急性期的細(xì)胞免疫應(yīng)答之后，于記憶性B 細(xì)胞中終身潛伏。人體不同感染狀態(tài)表達(dá)不同的抗原，主要有EBV 核心抗體、膜蛋白及小RNA。LMP?1 是其中一種潛伏期膜蛋白，臨床上常用免疫組化法檢測LMP?1 的表達(dá)，但LMP?1 多見于B 細(xì)胞感染的潛伏Ⅱ型，在胃癌細(xì)胞中較少表達(dá)或者不表達(dá)［3］。而EBER 是EBV 在潛伏期表達(dá)最多的病毒基因，通過探針與待測轉(zhuǎn)錄本結(jié)合，可特異性鑒別感染EBV 的細(xì)胞，陽性率高達(dá)95%，因此，作為EBV 檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。

研究報道EBV 相關(guān)性胃癌（EBV associated gastric carcinoma，EBVaGC）在胃癌中的比例為6%～12%［4?5］。多數(shù)研究顯示，相對于EBV陰性胃癌（Epstein?Barr virus negative gastric carcinoma，EBVnGC），EBVaGC 患者具有獨特的臨床病理特征。 EBVaGC 患者更年輕，更常見于男性，原發(fā)性腫塊較小，腸型胃癌較多見，好發(fā)于食管胃交界處以及殘胃，并具有較低的臨床分期和更好的整體生存率［4，6?7］。一項全球4599 例患者的薈萃分析顯示，EBVaGC 患者的中位生存期為8.5年，EBVnGC僅有5.3年［4］。本研究并未發(fā)現(xiàn)EBV 感染在患者年齡、性別及腫塊大小、腫塊部位以及病理分期上顯著的差異，可能與收集樣本數(shù)目有關(guān)，擴大樣本量以及樣本種類，可能對結(jié)果更具有提示意義；大部分研究認(rèn)為EBVaGC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低［8］，鑒于大于6 枚的淋巴結(jié)發(fā)生癌轉(zhuǎn)移與胃癌臨床預(yù)后關(guān)系密切，本文在此類型患者中僅發(fā)現(xiàn)1 人感染，與文獻(xiàn)報道也相符合。同時本研究發(fā)現(xiàn)EBV 感染與lauren 分型有關(guān)，在感染的混合性胃癌病例中，EBV 多感染管狀腺癌成分。并且，在富含淋巴細(xì)胞浸潤、腺管分化較差的腺癌中也易見EBER 的表達(dá)，此類型胃癌稱之為髓樣癌，又叫胃淋巴上皮樣癌，與EBV 感染極為密切［9?10］。研究報道，胃淋巴上皮樣癌由于腫瘤突變負(fù)荷增加以及免疫調(diào)節(jié)分子誘導(dǎo)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞在腫瘤間質(zhì)大量富集［11］。這里需要提出的，在癌旁可觀察到異型增生的腺管合并有EBV 感染，這是否與腫瘤發(fā)生后免疫功能損傷有關(guān)還未可知。

在腫瘤的發(fā)生機制上，國內(nèi)外研究已證實EBV通過表達(dá)相關(guān)病毒基因逃避機體免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)細(xì)胞癌變，在胃癌發(fā)生早期發(fā)揮重要作用［8］。其根本的分子作用機制可能由于EBVaGC 中大量的基因啟動子發(fā)生甲基化，如細(xì)胞周期調(diào)控基因、凋亡基因、DNA 修復(fù)基因、細(xì)胞黏附和遷移基因及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因等［12?13］。高通量測序發(fā)現(xiàn)EBVaGC 存在高頻率的PIK3C 和ARID1A 基因突變［14］，也表明EBV 可能與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。并且EBVaGC 伴隨存在的高擴增的PD?L1 可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸［15］。

EBVaGC 是一種在流行病學(xué)，病因?qū)W，病理類型和分子機制上具有特異性的胃癌，臨床上較少見，EBER 原位雜交有助于對該疾病的診斷，從而為臨床EBVaGC 的篩查、診斷、治療和預(yù)后判斷提供可靠的病理學(xué)依據(jù)。