淳澤利,肖 欣,張 勇,王方遠(yuǎn),陳榮祥

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)研究院,遵義 563000;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 遵義市理化分析測(cè)試工程技術(shù)研究中心,遵義 563000)

大血藤又稱紅藤、紅皮藤、大活血等,系木通科藤本植物大血藤Sargentodoxa cuneata(Oliv.)Rehd.et Wils.的干燥藤莖,具有清熱解毒、活血、祛風(fēng)等功效,常用于腸癰腹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、風(fēng)濕痹痛、跌撲腫痛等[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明大血藤及其提取物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌等藥理作用[2-3]。大血藤的化學(xué)成分主要有酚酸類、苯乙醇類、苯丙酸類、木脂素類、黃酮類、三萜類等化合物[2,4-5],其中酚酸類(原兒茶酸等)、苯乙醇類(紅景天苷、羥基酪醇、酪醇等)和苯丙酸類(綠原酸、隱綠原酸等)化合物在數(shù)量和質(zhì)量上都占有較大比例[4]。

對(duì)于大血藤中化學(xué)成分含量的測(cè)定,文獻(xiàn)報(bào)道大多是針對(duì)綠原酸、紅景天苷、原兒茶酸、表兒茶素等,未見(jiàn)兒茶素、羥基酪醇、酪醇、隱綠原酸含量測(cè)定的報(bào)道[6-9];在儀器檢測(cè)方面,文獻(xiàn)中多采用高效液相色譜法、超高效液相色譜法,配紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器(DAD)等光學(xué)檢測(cè)器,未見(jiàn)電化學(xué)檢測(cè)器(ECD)測(cè)定大血藤中化學(xué)成分含量的報(bào)道[6-10]。相較于傳統(tǒng)的光學(xué)檢測(cè)器,ECD 靈敏度高,可達(dá)fmol水平[11-12];并且選擇性強(qiáng),只對(duì)易于氧化還原的化合物有響應(yīng);同時(shí),ECD 的譜圖更為簡(jiǎn)潔[13]。庫(kù)侖檢測(cè)池和安培檢測(cè)池為ECD 中常用的兩種檢測(cè)池,其中安培檢測(cè)池工作電極的材料多樣,金、銀、鉑、玻碳等均為常見(jiàn)的工作電極,通過(guò)調(diào)節(jié)工作電極與對(duì)電極的間隙可提高檢測(cè)的靈敏度,但其表面積較小,長(zhǎng)時(shí)間使用易造成電極污染,需要對(duì)電極進(jìn)行定期維護(hù);庫(kù)侖檢測(cè)池工作電極的材料較為單一,通常為多孔石墨電極,其表面積遠(yuǎn)大于安培檢測(cè)池的工作電極,抗污染能力強(qiáng),同時(shí)待測(cè)化合物在多孔石墨電極上可接近完全氧化,響應(yīng)值也較高[14-15]。目前,ECD 已用于酚酸、抗生素、氨基酸等物質(zhì)的檢測(cè),并廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)境、化學(xué)等領(lǐng)域[12-17]。

羥基酪醇、原兒茶酸、紅景天苷、酪醇、兒茶素、隱綠原酸、綠原酸及表兒茶素均含有酚羥基,極易被氧化,可直接采用ECD 在直流模式下進(jìn)行檢測(cè)。鑒于此,本工作提出了超高效液相色譜法-ECD 測(cè)定大血藤藥材中綠原酸、紅景天苷、羥基酪醇等8種化學(xué)成分的含量,為大血藤藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

U3000型超高效液相色譜儀,配Chromeleon 7.1工作站、ECD-3000 RS(檢測(cè)池為6011庫(kù)侖檢測(cè)池,工作電極為多孔石墨電極,參比電極為鈀電極)及DAD-3400 RS等檢測(cè)器;Legend Micro 17小型臺(tái)式離心機(jī);SB-5200DT 型超聲波清洗機(jī);ME104E型電子分析天平;FE 28型pH 計(jì);Purelab Chorus超純水系統(tǒng)。

檸檬酸鹽緩沖液(pH 2.76):50 mmol·L－1,分別稱取檸檬酸4.6 g、一水合檸檬酸鉀0.8 g,加入500 mL水,溶解并混勻,抽濾。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:稱取適量的羥基酪醇、原兒茶酸、紅景天苷、酪醇、兒茶素、隱綠原酸、綠原酸和表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解,配制成質(zhì)量濃度為2 g·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于4 ℃冰箱冷藏,備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:移取適量的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用50%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液稀釋,配制成羥基酪醇、原兒茶酸、兒茶素、隱綠原酸質(zhì)量濃度為20 mg·L－1,紅景天苷質(zhì)量濃度為100 mg·L－1,酪醇質(zhì)量濃度為5 mg·L－1,綠原酸質(zhì)量濃度為400 mg·L－1,表兒茶素質(zhì)量濃度為200 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用時(shí),用50%甲醇溶液稀釋至所需質(zhì)量濃度。

酪醇標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于98%,批號(hào)H1 817069;紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于98%,批號(hào)G1 817039;羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于98.30%,批號(hào)AK-45213;綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于98%,批號(hào)J1 523050;原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于97%,批號(hào)K1 717091;表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于97%,批號(hào)L1 824045;隱綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.28%,批號(hào)71 900010;兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于97%,批號(hào)ZNJZK-HM。

甲醇、乙腈為色譜純;一水合檸檬酸鉀、檸檬酸為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

24批大血藤樣品采自貴州、廣西、安徽、云南、湖北、陜西、四川、廣東等地,參考《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版(簡(jiǎn)稱Ch P 2020),經(jīng)筆者鑒定為木通科藤本植物大血藤的干燥藤莖。

1.2 儀器工作條件

Waters ACQUITY UPLC?BEH Shield RP18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫45 ℃;流動(dòng)相A 為乙腈,B 為50 mmol·L－1檸檬酸鹽緩沖液(pH 2.76);流量0.4 mL·min－1;進(jìn)樣量1μL;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度10 ℃。梯度洗脫程序:0～3 min時(shí),A 為5%;3～6 min 時(shí),A 由5%升 至10%,保持3 min。ECD 庫(kù)侖檢測(cè)池的檢測(cè)電壓,第一通道為350 mV(用于檢測(cè)羥基酪醇、原兒茶酸、隱綠原酸、綠原酸、兒茶素和表兒茶素),第二通道為600 mV(用于檢測(cè)紅景天苷、酪醇)。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取大血藤樣品粉末約1 g,過(guò)0.42 mm(60目)孔篩并記錄稱樣量;將其置于50 mL具塞試管中,加入30%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液30 mL,稱重;超聲提取10 min,冷卻,再稱重,加入30%甲醇溶液補(bǔ)足減失重量;將提取液以10 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min,上清液經(jīng)0.22μm 濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)器的選擇

試驗(yàn)嘗試選用DAD 對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示:羥基酪醇、紅景天苷、酪醇、兒茶素、表兒茶素在276～280 nm 內(nèi)有特異性紫外吸收;原兒茶酸的最大吸收波長(zhǎng)為260 nm;隱綠原酸、綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)為330 nm。因此,當(dāng)色譜柱、柱溫、流動(dòng)相、進(jìn)樣量等條件一致時(shí),設(shè)置DAD 的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為260,280,330 nm。

分別選用ECD 和DAD 對(duì)低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(其中羥基酪醇、原兒茶酸、兒茶素、隱綠原酸質(zhì)量濃度為0.25 mg·L－1,紅景天苷質(zhì)量濃度為1.25 mg·L－1,酪醇質(zhì)量濃度為0.062 5 mg·L－1,綠原酸質(zhì)量濃度為5 mg·L－1,表兒茶素質(zhì)量濃度為2.5 mg·L－1)進(jìn)行分析,所得色譜圖見(jiàn)圖1。以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),比較兩種檢測(cè)器的靈敏度,結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 ECD與DAD下的色譜圖Fig.1 Chromatograms with ECD and DAD

表1 ECD與DAD下8種化學(xué)成分的檢出限Tab.1 Detection limits of 8 chemical components with ECD and DAD

結(jié)果顯示:選用ECD 進(jìn)行檢測(cè)時(shí),8種化學(xué)成分均被檢出,如圖1(a)所示;選用DAD 進(jìn)行檢測(cè)時(shí),僅原兒茶酸、紅景天苷、隱綠原酸、綠原酸、表兒茶素被檢出,如圖1(b)所示;并且由表1可知,ECD的檢出限遠(yuǎn)低于DAD 的,表明ECD 具有較高的靈敏度。因此,試驗(yàn)選擇的檢測(cè)器為ECD。

2.2 檢測(cè)電壓的選擇

對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,考察了檢測(cè)電壓分別為0,50,100,150,200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700 mV 時(shí)對(duì)8種化學(xué)成分峰面積的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 檢測(cè)電壓對(duì)化學(xué)成分峰面積的影響Fig.2 Effect of detection voltage on the peak area of chemical component

結(jié)果表明:當(dāng)檢測(cè)電壓大于300mV時(shí),羥基酪醇、原兒茶酸、隱綠原酸、綠原酸峰面積較大并且保持平穩(wěn),說(shuō)明此時(shí)已被完全氧化,故選用350mV 為羥基酪醇、原兒茶酸、隱綠原酸、綠原酸的檢測(cè)電壓;當(dāng)檢測(cè)電壓小于400mV時(shí),紅景天苷和酪醇峰面積較小,幾乎沒(méi)有被氧化,當(dāng)檢測(cè)電壓升高至600mV時(shí),二者的峰面積較大,被完全氧化,故選用600mV為紅景天苷和酪醇的檢測(cè)電壓;當(dāng)檢測(cè)電壓為250mV時(shí),兒茶素和表兒茶素氧化達(dá)到第一個(gè)平臺(tái),250～400mV時(shí),二者峰面積穩(wěn)定,超過(guò)400mV時(shí),兒茶素和表兒茶素的峰面積隨檢測(cè)電壓的升高而增大,故選用350mV為兒茶素和表兒茶素的檢測(cè)電壓。

2.3 提取條件的選擇

2.3.1 提取方式

試驗(yàn)考察了回流提取、超聲提取對(duì)大血藤樣品中8種化學(xué)成分峰面積的影響。結(jié)果表明,經(jīng)兩種方式提取后,8種化學(xué)成分的峰面積無(wú)明顯差異,但超聲提取相對(duì)省時(shí)、方便,操作誤差較小,因此試驗(yàn)選擇的提取方式為超聲提取。

2.3.2 甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)

固定提取時(shí)間為10 min,提取1次,考察了甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)分別為15%,30%,45%,60%,75%,90%時(shí)對(duì)大血藤樣品中8種化學(xué)成分總峰面積的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)對(duì)8種化學(xué)成分總峰面積的影響Fig.3 Effect of volume fraction of methanol solution on the total peak area of 8 chemical components

由圖3可知,當(dāng)甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí),大血藤樣品中8種化學(xué)成分總峰面積較高,因此試驗(yàn)選擇的甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為30%。

2.3.3 提取時(shí)間

以30%甲醇溶液為提取溶劑,提取1次,考察了超聲提取時(shí)間分別為5,10,15,20,30,45 min時(shí)對(duì)大血藤樣品中8種化學(xué)成分總峰面積的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知,當(dāng)超聲提取10 min時(shí),8種化學(xué)成分的總峰面積較高,因此試驗(yàn)選擇的提取時(shí)間為10 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)8種化學(xué)成分總峰面積的影響Fig.4 Effect of extraction time on the total peak area of 8 chemical components

2.3.4 提取次數(shù)

以30% 甲醇溶液為提取溶劑,超聲提取10 min,分別提取大血藤樣品1,2次,考察了提取次數(shù)對(duì)8種化學(xué)成分峰面積的影響,提取1次的大血藤樣品進(jìn)樣前采用30%甲醇溶液按1∶1體積比稀釋。結(jié)果表明,提取次數(shù)對(duì)大血藤樣品中8種化學(xué)成分峰面積無(wú)明顯影響,考慮到試驗(yàn)操作方便,選擇的提取次數(shù)為1次。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

移取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用50%甲醇溶液逐級(jí)稀釋,配制成羥基酪醇、原兒茶酸、兒茶素、隱綠原酸質(zhì)量濃度為0.5,1,2,5,10,20 mg·L－1,紅景天苷質(zhì)量濃度為2.5,5.0,10,25,50,100 mg·L－1,酪醇質(zhì)量濃度為0.125,0.250,0.500,1.25,2.50,5.00 mg·L－1,綠原酸質(zhì)量濃度為10,20,40,100,200,400 mg·L－1,表兒茶素質(zhì)量濃度為5,10,20,50,100,200 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,以各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性參數(shù)見(jiàn)表2。

8種化學(xué)成分的檢出限結(jié)果見(jiàn)2.1 節(jié)中表1。以10倍信噪比計(jì)算測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性參數(shù)和測(cè)定下限Tab.2 Linearity parameters and lower limits of determination

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 儀器精密度

按照儀器工作條件,對(duì)羥基酪醇、原兒茶酸、兒茶素、隱綠原酸質(zhì)量濃度為0.5 mg·L－1,紅景天苷質(zhì)量濃度為2.5 mg·L－1,酪醇質(zhì)量濃度為0.125 mg·L－1,綠原酸質(zhì)量濃度為10 mg·L－1,表兒茶素質(zhì)量濃度為5 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次,記錄峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示,羥基酪醇、原兒茶酸、紅景天苷、酪醇、兒茶素、隱綠原酸、綠原酸和表兒茶素峰面積的RSD依次為0.40%,0.29%,2.0%,1.5%,0.43%,0.35%,0.39%和0.38%,表明儀器的精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性

按照試驗(yàn)方法對(duì)6份S1樣品進(jìn)行分析,計(jì)算各目標(biāo)物峰面積的RSD。結(jié)果顯示,羥基酪醇、原兒茶酸、紅景天苷、酪醇、兒茶素、隱綠原酸、綠原酸和表兒茶素峰面積的RSD依次為3.3%,2.2%,2.7%,2.9%,2.5%,1.6%,1.7%和1.6%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照儀器工作條件,分別在S1 樣品溶液放置0,2,4,6,8,10,12 h 時(shí)進(jìn)樣分析,計(jì)算各目標(biāo)物峰面積的RSD。結(jié)果顯示,羥基酪醇、原兒茶酸、紅景天苷、酪醇、兒茶素、隱綠原酸、綠原酸和表兒茶素峰面積的RSD依次為1.5%,1.8%,4.2%,3.4%,1.7%,1.4%,0.91%和1.3%,表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.7 回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)6份S1樣品(0.501 7±0.002 1)g進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of test for recovery(n＝6)

2.8 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)24批不同產(chǎn)地的大血藤藥材進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表4。其中S1樣品溶液的色譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 S1樣品溶液的色譜圖Fig.5 Chromatograms of S1 sample solution

由表4可知,24批不同產(chǎn)地大血藤樣品中綠原酸含量較高,其次是表兒茶素和紅景天苷,羥基酪醇、原兒茶酸、酪醇、兒茶素和隱綠原酸的含量均低于1 mg·g－1。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of the samples

表4 (續(xù))

ChP2020中規(guī)定大血藤中紅景天苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.040%,綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.20%。24批樣品中,S4,S15,S16,S18中紅景天苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.033%,0.037%,0.035%,0.017%,小于0.040%,不符合ChP2020的規(guī)定;S2,S3,S15,S18 中,綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.16%,0.17%,0.18%,0.08%,小于0.20%,不符合ChP 2020的規(guī)定。由此可見(jiàn),S15和S18樣品為偽劣藥材。

本工作通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)條件、提取條件,提出了超高效液相色譜法-ECD 測(cè)定大血藤中8種化學(xué)成分含量的方法。該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏,能夠較全面、客觀地反映不同產(chǎn)地大血藤樣品中8種化學(xué)成分的含量差異,對(duì)于評(píng)價(jià)大血藤質(zhì)量?jī)?yōu)劣有一定的參考價(jià)值。