字琴江 ,吳 凡 ,盧朝粉 ,李佳昕 ,劉夢婷 ,周川華?

(1.云南大學 化學科學與工程學院 國家級化學化工實驗教學中心,昆明 650091;2.洱源縣檢驗檢測院,洱源 671200)

癌胚抗原(CEA)是目前臨床上最有價值的腫瘤標志物之一[1],健康成年人血清中CEA 質量濃度低于2.5μg·L－1[2],而腫瘤疾病患者由于惡性腫瘤細胞調控受損后會重新啟動蛋白的合成,導致血清中CEA 濃度水平升高[3]。因此,測定腫瘤患者血清中CEA 的含量,對監(jiān)控腫瘤性疾病的轉移、復發(fā)具有一定的參考價值。

近年來,為了準確測定腫瘤標志物的含量,科研工作者開發(fā)了很多定量分析方法,其中免疫分析法由于具有抗干擾能力強、靈敏度高的優(yōu)點,引起了人們廣泛的關注。常見的免疫分析法有電化學免疫傳感器[4]、酶聯(lián)免疫傳感器[5]、放射性免疫傳感器[6]和化學發(fā)光免疫傳感器[7]等?；瘜W發(fā)光免疫傳感器是將免疫反應與化學發(fā)光檢測手段相結合構建的一種生物傳感器[8]。該方法一般采用酶或化學發(fā)光物質對抗體或抗原進行標記,然后利用抗體和抗原之間的特異性反應形成免疫復合物,最后根據(jù)信號標記物的化學發(fā)光強度來實現(xiàn)目標物的定性、定量檢測。該分析方法在核酸[9]、細胞[10]、蛋白質[11]、腫瘤標志物[12]的檢測方面已有廣泛應用。如何提高方法的檢測靈敏度,實現(xiàn)復雜樣品中目標物的高靈敏檢測是科研工作者努力的方向。

在免疫傳感器的構建過程中,固相載體會極大地影響傳感器的性能。以納米材料作為生物分子的固相載體受到人們廣泛的青睞,其中磁性納米粒子由于比表面積大、表面易于修飾、生物相容性好、易于分離富集和催化性能好等優(yōu)點,被人們廣泛地用于生物分子的富集、純化和分離[13]。

本工作基于免疫磁分離和酶催化放大策略,構建了一種高靈敏的化學發(fā)光免疫傳感器,并將其應用于腫瘤標志物的檢測。以磁球(MB)作為免疫反應的固相載體,辣根過氧化物酶(HRP)作為信號標記物,首先通過抗原-抗體特異性識別反應在MB表面形成磁性免疫夾心復合物,然后利用其表面的HRP催化魯米諾-過氧化氫體系產生化學發(fā)光,根據(jù)化學發(fā)光強度來實現(xiàn)CEA 的檢測,為測定人血清中CEA 的含量提供了一種新的手段。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

THMR-0594型磁力架;UV-2550 型紫外可見分光光度計;Malvern Zetasizer Nano ZS90型動態(tài)光散射粒徑儀;MPI-E型電致化學發(fā)光檢測儀。

磷酸鹽緩沖溶液(PBS):0.1 mol·L－1,稱取1.56 g二水合磷酸二氫鈉,3.58 g十二水合磷酸氫二鈉,用水定容至100 mL,再用0.1 mol·L－1磷酸溶液和0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液調節(jié)溶液酸度分別為pH 6.0,7.2,8.0,于4 ℃保存。

羧基功能化的超順磁性MB 標準溶液:50 g·L－1,MB粒徑為500 nm,批號為02130。

CEA 標準溶液:2.1 g·L－1,使用時,用PBS(pH 7.2)稀釋至所需質量濃度。

CEA 單克隆抗體Ab1和Ab2的單標準溶液:Ab1質量濃度為6.4 g·L－1,Ab2質量濃度為4.2 g·L－1,使用時,用PBS(pH 7.2)稀釋至所需質量濃度。

脫脂奶粉的純度為99.9%;生物素化試劑(sulfo-NHS-LC-biotin)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)標準品、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)標準品、魯米諾標準品的純度均為98%;鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶(SA-HRP)標準品的純度為90%;其他試劑均為分析純;試驗用水為超純水(電阻率為18.25 MΩ·cm)。

1.2 儀器工作條件

光電倍增管電壓600 V;測量時間1 000 s;采樣速率10 T·s－1;放大級數(shù)3;進樣方式為手動注射。

1.3 試驗方法

1.3.1 MB-Ab1與Ab2-biotion的制備[14]

取5μL羧基功能化的超順磁性MB 標準溶液(50 g·L－1),用PBS(pH 6.0)洗滌3次,然后將其分散到200 μL含有0.1 mol·L－1NHS 和0.1 mol·L－1EDC 的PBS(pH 6.0)中,以轉速130 r·min－1于37 ℃恒溫搖床中活化40 min。用PBS(pH 7.2)洗 滌3 次,然后分散到600μL 含0.21 g·L－1CEA 單克隆抗體Ab1的PBS(pH 7.2)中,于37 ℃恒溫搖床中反應12 h。再用PBS(pH 7.2)洗滌3次,除去多余的Ab1,然后分散到600μL含1%(質量分數(shù),下同)牛血清白蛋白(BSA)的PBS(pH 7.2)中封閉30 min。用PBS(pH 7.2)洗滌3次,然后分散到600μL 含1%BSA 和0.05%(質量分數(shù),下同)Na N3的PBS(pH 7.2)中,得到復合物MB-Ab1,于4 ℃冷藏保存,備用。

取20μL CEA 單克隆抗體Ab2標準溶液(0.64 g·L－1),用PBS(pH 7.2)稀釋至200μL,然后加入10μL 新配制的1 g·L－1sulfo-NHS-LCbiotin溶液,以轉速130 r·min－1于37 ℃恒溫搖床中孵育3 h,采用NAP-5脫鹽柱除去多余的sulfo-NHS-LC-biotin,利用紫外可見分光光度計測定生物素化抗體Ab2-biotion在280 nm 處的吸光度值并對其進行定量。然后加入20μL 含1% BSA 和0.05%(質量分數(shù),下同)NaN3的PBS(pH 7.2),得到復合物Ab2-biotion,于4 ℃冷藏保存,備用。

1.3.2 MB-Ab1-CEA-Ab2-biotion-SA-HRP的制備

取20μL MB-Ab1,分散在100μL CEA 標準溶液或10μL 新鮮人血清樣品中,以轉速130 r·min－1于37 ℃恒溫搖床中反應30 min,采用磁力架分離,以含0.05%(質量分數(shù))吐溫和0.4%(質量分數(shù))脫脂奶粉的PBS(pH 7.2)為洗液,洗滌2次,除去未反應的CEA 和其他雜質,再用PBS(pH 7.2)除去吸附的洗液,得到復合物MB-Ab1-CEA。將上述MB-Ab1-CEA 分散到100μL 含10 mg·L－1Ab2-biotion的PBS(pH 7.2)中,以轉速130 r·min－1于37 ℃恒溫搖床中孵育30 min,用磁力架分離,洗液洗滌2次,再用PBS(pH 7.2)清洗,除去未反應的Ab2-biotion,得到復合物 MB-Ab1-CEA-Ab2-biotion。將上述MB-Ab1-CEA-Ab2-biotion 分散到100μL含10 mg·L－1的SA-HRP的PBS(pH 7.2)中,以轉速130 r·min－1于37 ℃恒溫搖床中孵育35 min,采用磁力架吸附MB,分別用洗液和PBS(pH 7.2)各洗滌2次,除去多余的SA-HRP,得到標記HRP 的磁性免疫夾心復合物MB-Ab1-CEAAb2-biotion-SA-HRP。制備過程如圖1(a)所示。

1.3.3 CEA的測定

參照文獻[14],將MB-Ab1-CEA-Ab2-biotion-SA-HRP分散到2 mL 含1 mmol·L－1魯米諾和10 mmol·L－1過氧化氫的PBS(pH 8.0)中,采用電致化學發(fā)光檢測儀測定體系的化學發(fā)光強度。

MB-Ab1-CEA-Ab2-biotion-SA-HRP 表面的HRP 能催化過氧化氫分解形成羥基自由基(·OH),·OH 與魯米諾反應產生激發(fā)態(tài)魯米諾中間體,魯米諾中間體從激發(fā)態(tài)回到穩(wěn)定的基態(tài)時會產生光學輻射[15],通過檢測魯米諾的發(fā)光強度,進而對CEA 進行定量,原理示意圖如圖1(b)所示。

圖1 制備過程和原理示意圖Fig.1 Schematic diagrams of preparation process and principle

2 結果與討論

2.1 方法可行性

試驗考察了不同反應體系的化學發(fā)光強度,結果如圖2所示。

圖2 不同反應體系的化學發(fā)光強度Fig.2 Chemiluminescence intensity of different reaction systems

由圖2可知:當魯米諾反應液中只有過氧化氫(曲線2)或只有 MB-Ab1-CEA-Ab2-biotion-SAHRP(曲線3)時,體系的化學發(fā)光強度很弱;當魯米諾反應液中同時含有MB-Ab1-CEA-Ab2-biotion-SA-HRP和過氧化氫時,體系產生較強的化學發(fā)光信號,這是由于標記物HRP 可以催化過氧化氫產生大量的·OH,從而氧化魯米諾[16]。

利用動態(tài)光散射粒徑儀對一系列免疫復合物進行表征,結果如表1所示。

表1 免疫復合物的Zeta電勢和水合粒徑Tab.1 Zeta potential and hydrated particle size of the immune complex

由表1可見,隨著對MB的逐步修飾,免疫復合物的Zeta電勢和水合粒徑發(fā)生了明顯變化,表明目標物MB-Ab1-CEA-Ab2-biotion-SA-HRP 的順利合成。

2.2 反應時間的優(yōu)化

試驗考察了 MB-Ab1-CEA-Ab2-biotion-SAHRP制備過程中各階段反應時間對體系化學發(fā)光強度的影響,結果見圖3。

由圖3(a)可知,體系化學發(fā)光強度在MB-Ab1捕獲CEA 30 min時達到峰值;由圖3(b)可知,體系化學發(fā)光強度隨著MB-Ab1-CEA 與Ab2-biotion反應時間的延長先增加后趨于穩(wěn)定,反應時間過短時,免疫反應不完全,化學發(fā)光強度較小,當反應時間為30 min時,化學發(fā)光強度較大;由圖3(c)可知,化學發(fā)光強度隨著MB-Ab1-CEA-Ab2-biotion與SA-HRP反應時間的延長先增大后減小,當反應時間為35 min時,化學發(fā)光強度較大。因此,試驗選擇MB-Ab1與CEA 的反應時間為30 min,MB-Ab1-CEA 與Ab2-biotion的反應時間為30 min,MB-Ab1-CEAAb2-biotion與SA-HRP的反應時間為35 min。

圖3 反應時間對體系化學發(fā)光強度的影響Fig.3 Effect of reaction time on the chemiluminescence intensity of system

2.3 測定條件的優(yōu)化

試驗考察了過氧化氫濃度、魯米諾濃度以及體系酸度對體系化學發(fā)光強度的影響,結果如圖4所示。

圖4 過氧化氫濃度、魯米諾濃度、體系酸度對體系化學發(fā)光強度的影響Fig.4 Effects of H2 O2 concentration,luminol concentration and system acidity on the chemiluminescence intensity of system

由圖4(a)可知,隨著過氧化氫濃度的增加,體系的化學發(fā)光強度先增大后減小,當過氧化氫濃度為10 mmol·L－1時,體系化學發(fā)光強度較大,可能是由于過氧化氫濃度過高時,HRP 的活性會下降[17],同時共氧化作用導致化學發(fā)光強度下降[18]。由圖4(b)可知,體系化學發(fā)光強度在魯米諾濃度為1 mmol·L－1時達到頂點,之后隨著魯米諾濃度的增加,體系化學發(fā)光強度逐漸降低。由圖4(c)可知,體系化學發(fā)光強度在pH 8.0時達到頂點,之后隨著pH 的增大,體系化學發(fā)光強度逐漸下降,可能是由于pH 較高時,HRP 的催化活性降低。因此,試驗選擇的過氧化氫濃度為10 mmol·L－1,魯米諾濃度為1 mmol·L－1,體系酸度為pH 8.0。

2.4 干擾試驗

為了評估該化學發(fā)光免疫傳感器的特異性,選擇人血清中可能存在的葡萄糖氧化酶(GOD)、人血清白蛋白(HSA)、免疫球蛋白(IgG)和甲胎蛋白(AFP)作為干擾物,考察了上述干擾物對檢測CEA的干擾情況,結果見圖5。

圖5 干擾試驗結果Fig.5 Results of test for interference

由圖5可知,只有CEA 存在時,體系產生明顯的化學發(fā)光信號,并且GOD、HSA、IgG 和AFP 的加入基本不影響化學發(fā)光強度,表明該傳感器具有良好的特異性和抗干擾能力,這是由抗原-抗體的特異性結合所致。

2.5 標準曲線和檢出限

移取適量的CEA 標準溶液,用PBS(pH 7.2)逐級稀釋,配制成質量濃度為0.05,0.50,1.00,10.00,30.00,50.00,80.00μg·L－1的CEA 標準溶液系列,按照試驗方法進行測定。以CEA 的質量濃度為橫坐標,其對應的化學發(fā)光強度為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示,CEA 標準曲線的線性范圍為0.05～80.00μg·L－1,線性回歸方程為y＝108.4x＋528.6,相關系數(shù)為0.991 7。以信噪比為3時所對應的質量濃度為檢出限,結果為4.5 ng·L－1。

2.6 回收試驗

按照試驗方法,對實際人血清樣品進行加標回收試驗,結果見表2。

表2 回收試驗結果Tab.2 Results of test for recovery

2.7 方法比對

將本方法中所用的MB 與玻片[14]、96 孔板[19]分別作為固相載體進行比較,結果如圖6所示。

圖6 不同固相載體檢測CEA 的比較Fig.6 Comparison of different solid-phase carriers for the determination of CEA

在同一檢測條件下,本方法得到的化學發(fā)光強度分別是玻片和96孔板作為固相載體得到化學發(fā)光強度的2.4倍和5.2倍?？赡苁怯捎贛B 具有較大的比表面積,并且在水中分散良好,作為免疫反應的固相載體空間位阻較小,可以捕獲到更多的CEA。同時,CEA 抗體與MB 是通過共價鍵結合,而96孔板與抗體是通過物理吸附結合,作用力相對較弱。將本方法與文獻報道的其他化學發(fā)光免疫傳感器相比較,結果見表3。

表3 不同化學發(fā)光免疫傳感器檢測CEA的比較Tab.3 Comparison of different chemiluminescence immunosensors for the determination of CEA

結果顯示,與其他化學發(fā)光免疫傳感器相比,本方法所構建的傳感器具有更寬的線性范圍和更低的檢出限。

本工作將MB 作為固相載體,HRP 作為標記物,結合免疫磁分離技術和酶催化作用,構建了一種靈敏度高、選擇性好、特異性和抗干擾性強的CEA化學發(fā)光免疫傳感器,該傳感器具有較寬的線性范圍和較低的檢出限,在疾病的早期診斷方面具有良好的應用前景。