董雯，姜鳴鈺，陳文濤，劉文倩，陳青芳，趙順英，葉維貞，溫少紅，劉向榮

臨床研究證明，阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用能有效降低輕型缺血性卒中和TIA患者的卒中復(fù)發(fā)率[1-2]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用的最佳持續(xù)時(shí)間為卒中發(fā)生后的21 d[3]，但目前阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合作用的機(jī)制尚不明確。

中性粒細(xì)胞是人體固有免疫系統(tǒng)中重要的效應(yīng)細(xì)胞，主要產(chǎn)生于骨髓[4]。腦缺血后，中性粒細(xì)胞通過(guò)分泌炎癥因子，釋放自由基，形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）增加血栓形成等機(jī)制介導(dǎo)腦缺血損傷[5]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞[6]，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞根據(jù)功能主要分為促炎（M1）和抗炎（M2）兩種極化表型[7]。腦缺血后，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)腦缺血損傷還是神經(jīng)保護(hù)作用取決于其在促炎和抗炎表型中的動(dòng)態(tài)平衡[8]。本研究利用小鼠大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端缺血再灌注模型分析阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腦缺血后骨髓中性粒細(xì)胞分泌的炎癥因子、小膠質(zhì)細(xì)胞3D形態(tài)以及極化狀態(tài)的影響，以探索雙聯(lián)抗血小板治療可能的作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性C57BL/6小鼠20只（8～10周齡，體質(zhì)量25±0.5 g，北京華阜康生物科技控股有限公司），飼養(yǎng)于12 h循環(huán)照明，溫度22～24 ℃環(huán)境中，自由攝食水。本實(shí)驗(yàn)遵照動(dòng)物倫理（批號(hào)：202002003）相關(guān)要求進(jìn)行。

1.2 模型制作與分組 模型制作：小鼠異氟烷麻醉后取右側(cè)臥位，在右耳和右眼之間正中開口，找到并結(jié)扎大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端。1 h后解開結(jié)扎線實(shí)現(xiàn)再灌注。術(shù)中通過(guò)監(jiān)測(cè)腦血流判斷模型成功。術(shù)中小鼠肛溫保持在37±0.5 ℃。

模型成功后小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和雙抗組，每組各10只。對(duì)照組在再灌注即刻通過(guò)灌胃給予飲用水100 μL；雙抗組在再灌注即刻通過(guò)灌胃給予阿司匹林（劑量12 mg/kg，每只實(shí)際用量0.3 mg）與氯吡格雷（劑量12 mg/kg，每只實(shí)際用量0.3 mg）混懸液100 μL，每日1次，連續(xù)21 d。

1.3 骨髓中性粒細(xì)胞分離 應(yīng)用骨髓中性粒細(xì)胞分離試劑盒（索萊寶，中國(guó)）。造模后21 d處死小鼠，分離股骨和脛骨，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基沖洗髓腔以獲得骨髓，制備骨髓單細(xì)胞懸液，室溫離心，吸取中性粒細(xì)胞層。應(yīng)用清洗液重懸細(xì)胞，離心后備用。

1.4 炎癥因子測(cè)定 應(yīng)用RNA提取試劑盒（Qiagen，德國(guó)）提取骨髓中性粒細(xì)胞RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）將信使RNA（messenger RNA，mRNA）逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），之后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。應(yīng)用2-△△Ct計(jì)算對(duì)照組與雙抗組之間擴(kuò)增指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增指標(biāo)包括IL-1β、IL-6、IL-10、幾丁質(zhì)酶樣蛋白（chitinase-like 3，Chil3/YM1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（i nducible nitric-oxide synthase，iNOS）、TNFα、精氨酸酶1（arginase1，Arg1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β，TGFβ）、CD206、CD32。引物序列見(jiàn)表1[9]。

1.5 組織免疫熒光染色 小鼠腦組織固定后包埋，行冰凍切片。應(yīng)用Triton X100透化切片，室溫封閉1 h，之后進(jìn)行離子化鈣結(jié)合適配分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）（和光純藥，日本）和CD16（BD bioscience，美國(guó)）或Iba1和CD206（R&D Systems，美國(guó)）共染過(guò)夜。磷酸鹽吐溫緩沖液洗后，應(yīng)用抗兔（Jackson，711-545-152）、抗大鼠（Jackson，712-165-150）和抗羊（Jackson，705-165-003）熒光二抗分別進(jìn)行標(biāo)記。CD16+Iba1+標(biāo)記梗死周邊區(qū)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞；CD206+Iba1+標(biāo)記梗死周邊區(qū)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞。使用激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss，德國(guó)）拍攝圖像。應(yīng)用軟件Imaris 9.0.1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞3D圖像進(jìn)行分析，包括細(xì)胞突起長(zhǎng)度、突起數(shù)量、突起分叉點(diǎn)數(shù)量和終末點(diǎn)數(shù)量。應(yīng)用Image J軟件統(tǒng)計(jì)CD16和Iba1雙陽(yáng)以及CD206和Iba1雙陽(yáng)細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 使用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，用表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓中性粒細(xì)胞相關(guān)炎癥因子表達(dá)情況與對(duì)照組相比，雙抗組促炎因子I L-1β的mRNA水平下降，抗炎因子YM1和CD206的mRNA水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2組其他炎癥因子的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 腦缺血再灌注后21 d骨髓中性粒細(xì)胞炎癥因子相對(duì)表達(dá)量

2.2 腦缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化對(duì)單個(gè)小膠細(xì)胞形態(tài)的3D分析顯示，與對(duì)照組相比，雙抗組腦梗死周邊區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞突起長(zhǎng)度（109.40±23.42 μmvs. 92.48±28.25 μm，P=0.014）、突起數(shù)量（58.63±39.55個(gè)vs. 13.27±10.54個(gè)，P<0.001）、突起分叉點(diǎn)數(shù)量（25.43±17.54個(gè)vs. 5.70±5.03個(gè)，P<0.001）、突起終末點(diǎn)數(shù)量（30.00±19.97個(gè)vs. 7.63±5.55個(gè)，P<0.001）均增加（圖1）。2.3 腦缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài) 腦缺血再灌注21 d后雙抗組與對(duì)照組梗死周邊區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，單位面積（1 mm2）中分別有395.5±85.59個(gè)和413.3±97.84個(gè)（P=0.588）。但2組的小膠質(zhì)細(xì)胞極化情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雙抗組和對(duì)照組梗死周邊區(qū)域單位面積（1 mm2）中CD16陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞分別有119.4±37.43個(gè)和220.2±63.07個(gè)，雙抗組較低（P<0.001）；C D 2 0 6 陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量分別為198.2±40.16個(gè)和122.8±29.88個(gè)，雙抗組較高（P<0.001）（圖2）。

圖1 腦缺血再灌注后21 d腦組織梗死周邊區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)

圖2 腦缺血再灌注后21 d不同組別腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)

3 討論

本研究應(yīng)用小鼠輕型急性腦缺血再灌注模型，連續(xù)21 d給予阿司匹林和氯吡格雷灌胃，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥顯著降低骨髓中性粒細(xì)胞促炎因子IL-1β的表達(dá)，同時(shí)提高抗炎因子YM1和CD206的表達(dá)。聯(lián)合用藥增加腦梗死周邊區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞分支，同時(shí)促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化。以上結(jié)果提示，阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用可能通過(guò)降低骨髓和腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)腦缺血損傷。

炎癥是腦缺血后主要的病理過(guò)程，同時(shí)也是影響卒中預(yù)后的重要因素[10]。中性粒細(xì)胞被認(rèn)為是固有免疫系統(tǒng)的第一道防線。臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明，中性粒細(xì)胞的功能異質(zhì)性取決于疾病和炎癥階段[11]。促炎型即N1型中性粒細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生IL-1β、TNFα、NO和過(guò)氧化氫等細(xì)胞因子或效應(yīng)因子，加重炎癥損傷。相反，N2型中性粒細(xì)胞表達(dá)YM1、CD206和Arg1[12]，并產(chǎn)生抗炎因子IL-10、TGFβ和VEGF等，有助于組織重建和損傷修復(fù)，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用[13]。本研究中，雙抗組促炎因子水平降低，抗炎因子水平升高，提示阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合用藥可能通過(guò)提高中性粒細(xì)胞的抗炎作用促進(jìn)腦缺血損傷的恢復(fù)。

靜息狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)突觸擺動(dòng)執(zhí)行免疫監(jiān)視功能，維持腦組織內(nèi)微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡[14]。疾病狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為突起數(shù)量、分叉點(diǎn)數(shù)量和終末點(diǎn)數(shù)量增多，以便提高小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫監(jiān)測(cè)范圍[15]。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后分為促炎（M1型）或抗炎（M2型）兩種表型。M1極化表型通過(guò)釋放促炎因子加速腦缺血損傷進(jìn)程；M2型具有抗炎功能，可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞存活[8]。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是治療腦缺血損傷的潛在方向之一。本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用之后，腦梗死周邊區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)出多突起多分支狀，擴(kuò)大了其免疫監(jiān)測(cè)范圍；另外，小膠質(zhì)細(xì)胞向M2抗炎表型轉(zhuǎn)化，提示雙抗聯(lián)合用藥可抑制梗死周邊的炎癥反應(yīng)。

小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活可通過(guò)加重腦白質(zhì)損傷導(dǎo)致認(rèn)知功能下降[16]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，阿司匹林與氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用能顯著改善腦缺血小鼠的認(rèn)知功能[17]。結(jié)合本課題組一系列研究結(jié)果，提示阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用可通過(guò)減少骨髓中性粒細(xì)胞和腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。然而，聯(lián)合用藥如何影響骨髓中性粒細(xì)胞抗炎和促炎因子的釋放以及小膠質(zhì)細(xì)胞的極化還需進(jìn)一步的探索。

【點(diǎn)睛】本研究在小動(dòng)物缺血再灌注模型中驗(yàn)證了阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用21 d可提高骨髓中性粒細(xì)胞的抗炎作用以及調(diào)節(jié)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與極化，提示雙聯(lián)抗血小板治療可能通過(guò)上述機(jī)制起到抑制腦缺血損傷的作用。