海珍珍，范永鑫，馬小霞，馬海娟，張東濤，周學(xué)章

(1 寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130015)

奶牛乳腺炎是獸醫(yī)臨床常見病，由多種微生物引起，目前從患病奶牛奶樣中分離出的病原微生物已達(dá)150多種，涉及細(xì)菌、病毒、支原體等種類，其中細(xì)菌以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和停乳鏈球菌為主[1]。金黃色葡萄球菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，有報(bào)道稱5%～50%的奶牛乳腺炎由金黃色葡萄球菌感染所致[2]，其能夠分泌α或β溶血素、殺白細(xì)胞素、超級(jí)抗原、蛋白酶A等多種免疫逃避因子，通過黏附、定殖、入侵的方式引起宿主細(xì)胞不同程度的損傷。PV-殺白細(xì)胞素(Panton-Valentine leukocidin,PVL)是金黃色葡萄球菌分泌的一種雙組分成孔毒素，其可與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，形成一環(huán)狀結(jié)構(gòu)的八聚體并在宿主細(xì)胞膜上形成孔道，進(jìn)而損傷細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡并最終裂解[3]。近年來PVL基因在患乳腺炎奶牛乳汁中的檢出率逐漸升高，壽何慶等[4]分離的277株臨床金黃色葡萄球菌菌株中，15.5%攜帶PVL基因；2021年陳婷婷等[5]調(diào)查了甘肅省部分地區(qū)牛源金黃色葡萄球菌常見毒力因子的分布情況，其中PVL基因陽性菌株率為14.3%?？梢娊瘘S色葡萄球菌PVL在導(dǎo)致奶牛乳腺炎發(fā)生過程中起著重要作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是真核細(xì)胞普遍存在的應(yīng)激-防御機(jī)制，自噬則是真核細(xì)胞內(nèi)相對(duì)保守的降解機(jī)制，研究表明，二者相互影響，與炎癥和疾病的發(fā)展密切相關(guān)[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)PVL金黃色葡萄球菌、PVL基因缺失(ΔPVL)金黃色葡萄球菌和體外重組PVL(rPVL)均能引起奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)的凋亡，但由于PVL蛋白表達(dá)水平的差異，產(chǎn)PVL菌株引起的BMECs凋亡率和壞死率明顯高于ΔPVL株[7]。陸娟等[8]研究表明，表達(dá)PVL的金黃色葡萄球菌可誘導(dǎo)人THP-1單核細(xì)胞自噬和凋亡。關(guān)于產(chǎn)PVL金黃色葡萄球菌在BMECs中是否會(huì)加劇細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬目前尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)用產(chǎn)PVL金黃色葡萄球菌菌株ATCC49775、ΔPVL49775和rPVL感染BMECs，初步探究PVL對(duì)BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬程度的影響，以期為完善金黃色葡萄球菌及PVL感染BMECs的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與細(xì)胞 產(chǎn)PVL金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49775，購(gòu)自美國(guó)典型菌種保存中心；PVL基因缺失金黃色葡萄球菌菌株ΔPVL49775，由哈爾濱獸醫(yī)研究所張萬江研究員課題組提供。奶牛乳腺上皮細(xì)胞系，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.2 主要試劑 體外重組PV-殺白細(xì)胞素(rPVL)，由寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周學(xué)章教授課題組原核表達(dá)并純化保存；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)和胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)，均購(gòu)自青島海博生物公司；DMEM-High Glucose培養(yǎng)液、胰蛋白酶EDTA溶液(2.5 g/L胰蛋白酶,0.2 g/L EDTA,酚紅)，均購(gòu)自以色列BI公司；胎牛血清(FBS)，購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒、CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒、全蛋白提取試劑盒，均購(gòu)自南京凱基生物公司；超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海雅酶生物公司；PVDF膜，購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)、溶葡萄球菌酶、4 g/L多聚甲醛，均購(gòu)自北京索萊寶生物公司；兔抗CHOP、GRP78、LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin 1、p62以及鼠抗GAPDH一抗，均購(gòu)自江蘇親科生物公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗鼠二抗，均購(gòu)自北京中杉金橋生物公司；蛋白Maker(14～120 ku)、6×Protein Loading Buffer，均購(gòu)自北京全式金生物公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌的培養(yǎng) 將金黃色葡萄球菌菌株ATCC49775與ΔPVL49775劃線接種于TSA平板培養(yǎng)基后，于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，挑取單菌落于TSB液體培養(yǎng)基，放置于37 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床中純培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，離心(5 000 r/min，5 min)收集菌體，1×PBS清洗2次，最后用DMEM-High Glucose培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)菌密度為后續(xù)試驗(yàn)所需密度。

1.2.2 BMECs的復(fù)蘇與培養(yǎng) 將完全培養(yǎng)基預(yù)熱并在超凈工作臺(tái)中吸取適量于離心管中，將凍存于液氮罐中的BMECs迅速取出，立即置于37 ℃無菌水浴鍋中輕輕晃動(dòng)使其快速融化。待細(xì)胞完全融化后轉(zhuǎn)移至離心管中離心(1 000 r/min，5 min)洗滌，去除有毒物質(zhì)，此步驟重復(fù)2次。最后一次離心結(jié)束后移去上清液，加入1 mL完全培養(yǎng)液重懸后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2以及完全濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況及形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至 80%～90% 匯合時(shí)進(jìn)行消化傳代，如未達(dá)到所需細(xì)胞量，每48 h更換1次新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理 (1)金黃色葡萄球菌胞內(nèi)感染BMECs模型的建立。用2.5 g/L胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，用不含雙抗的完全培養(yǎng)基重懸，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。按4.0×105孔-1的量將細(xì)胞接種于六孔板，過夜貼壁培養(yǎng)后，消化1孔細(xì)胞重新計(jì)數(shù)，將其余孔的細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，用無菌1×PBS清洗細(xì)胞3次后，加入用DMEM調(diào)整好細(xì)菌密度的ATCC49775或ΔPVL49775菌懸液(感染復(fù)數(shù)=30)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別感染3和6 h。3 h感染組正常收樣，6 h感染組在細(xì)菌感染3 h后，用含溶葡萄球菌酶(10 mg/L)的DMEM培養(yǎng)液處理細(xì)胞12 min，殺死未入侵到細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，最后再更換為DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h，此步驟是為了保持3和6 h細(xì)菌感染組入侵細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)目一致，備檢。

(2)rPVL感染BMECs模型的建立。將BMECs按5.0×105孔-1的量接種于六孔板，過夜培養(yǎng)后，根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果，用100 ng/mL rPVL分別處理1，3和6 h，備檢。試驗(yàn)以正常BMECs為空白對(duì)照組(CK)。

1.2.4 自噬體的熒光顯微鏡觀察 單丹磺酰尸胺(dansylcadaverine,MDC )是一種熒光色素，為嗜酸性染色劑，常用作自噬體的特異性標(biāo)記染色劑。將上述建模的BMECs按2.0×105孔-1的量接種于提前放置好爬片的六孔板中過夜培養(yǎng)。去除培養(yǎng)液，用1×Wash buffer清洗細(xì)胞，用4 g/L多聚甲醛于4 ℃固定15 min，1×Wash buffer清洗后用MDC染色15 min，用1×Wash buffer清洗3次，每次5 min，將細(xì)胞爬片倒置于載玻片上，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察(激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355 nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)512 nm)并拍照。

1.2.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 棄去上述模型細(xì)胞六孔板中的舊培養(yǎng)液，使用1 mL預(yù)冷的無菌1×PBS洗滌2次，向六孔板中滴加70 μL Lysis Buffer(按照凱基全蛋白提取試劑盒說明配制)后將其置于冰上，慢速搖床上振蕩30 min裂解細(xì)胞；隨后用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞從六孔板底部刮下來收集到1.5 mL EP管中，置于冰上，在搖床上振蕩30 min使其充分裂解，4 ℃下12 000 r/min 離心10 min，將上清(細(xì)胞全蛋白提取物)轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，備用。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，采用Western blot法檢測(cè)BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(CHOP和GRP78)和自噬相關(guān)蛋白(LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin1和p62)的相對(duì)表達(dá)量。用BCA試劑盒測(cè)定各組全蛋白濃度后，使用Lysis Buffer和6×蛋白緩沖液調(diào)整全蛋白質(zhì)量濃度為2 μg/μL，金屬浴中放置10 min使蛋白充分變性。振蕩混勻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)印后的PVDF膜用5 g/L脫脂牛奶封閉1 h，1×TBST洗5次，每次6 min；加入稀釋好的一抗4 ℃過夜孵育，1×TBST洗5次，每次6 min；室溫下用二抗孵育1 h，1×TBST洗5次，每次6 min；最后加入超敏ECL發(fā)光液檢測(cè)目的蛋白，使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。所獲數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0分析軟件中的One-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌對(duì)BMECs自噬體熒光強(qiáng)度的影響

由圖1可知，ATCC49775、ΔPVL49775感染BMECs的藍(lán)色熒光強(qiáng)度均極顯著(P<0.01)高于CK；處理時(shí)間相同時(shí)，ATCC49775感染BMECs自噬體的熒光強(qiáng)度均極顯著(P<0.01)高于ΔPVL49775感染的BMECs。表明金黃色葡萄球菌感染可以加劇BMECs自噬體的生成，且PVL可以增強(qiáng)金黃色葡萄球菌的毒性作用。

ΔPVL 49775 3 h、ΔPVL 49775 6 h分別代表ΔPVL 49775感染后3和6 h處理，ATCC49775 3 h、 ATCC49775 6 h分別代表ATCC49775感染后3和6 h處理，圖3，4同。圖柱上標(biāo)**表示與CK差異極顯著(P<0.01)，標(biāo)##表示同一處理時(shí)間ATCC49775處理與ΔPVL 49775處理差異極顯著(P<0.01)

2.2 rPVL對(duì)BMECs自噬體熒光強(qiáng)度的影響

由圖2可知，rPVL處理BMECs的藍(lán)色熒光強(qiáng)度均極顯著高于CK(P<0.01)；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，rPVL處理BMECs的自噬體熒光強(qiáng)度逐漸下降。上述結(jié)果表明，rPVL感染可以加劇BMECs自噬體的形成，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，BMECs可以逐步修復(fù)rPVL帶來的損傷。

rPVL 1 h、 rPVL 3 h、 rPVL 6 h分別代表rPVL作用1，3和6 h處理,圖5,6同圖柱上標(biāo)**表示與CK差異極顯著(P<0.01)

2.3 金黃色葡萄球菌對(duì)BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

由圖3、圖4和表1可知，ATCC49775、ΔPVL49775感染后大部分時(shí)間，BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(CHOP和GRP78)和自噬相關(guān)蛋白(LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin1和p62)的表達(dá)水平顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于CK;ATCC49775感染BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于ΔPVL49775感染的BMECs,說明金黃色葡萄球菌感染可以加劇BMECs的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬程度，且PVL可以增強(qiáng)BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的程度。

圖3 金黃色葡萄球菌感染(MOI=30)BMECs后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的電泳結(jié)果

2.4 rPVL對(duì)BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

由圖5、圖6和表2可知，rPVL處理后大部分時(shí)間BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(CHOP和GRP78)和自噬相關(guān)蛋白(LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin1和p62)的表達(dá)水平極顯著(P<0.01)高于CK，說明rPVL加劇了BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的程度。

圖5 rPVL(質(zhì)量濃度100 ng/mL)處理后BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的電泳結(jié)果

圖6 rPVL(質(zhì)量濃度100 ng/mL)處理后BMECs自噬相關(guān)蛋白的電泳結(jié)果

表2 rPVL(質(zhì)量濃度100 ng/mL)對(duì)BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制、脂質(zhì)合成和鈣儲(chǔ)存[9]。在一些病理、逆境或生理(如細(xì)胞ATP水平波動(dòng)、Ca2+失衡、缺氧、病毒感染、炎性細(xì)胞因子刺激、營(yíng)養(yǎng)剝奪和環(huán)境毒素等)條件下，會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)喪失，蛋白折疊能力降低，最終導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白聚集，誘發(fā)其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而影響各種生物過程，如增殖、代謝、炎癥、自噬和細(xì)胞凋亡[10]。自噬是一種高度保守的基本細(xì)胞過程，通過循環(huán)利用有缺陷的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，自噬也可以通過各種先天性和適應(yīng)性免疫機(jī)制來消除細(xì)胞內(nèi)病原體，保護(hù)宿主細(xì)胞免受侵害[11]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬之間存在相互作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過PI3K/AKT/mTORC和AMPK/TSC/mTORC1途徑誘導(dǎo)自噬[12-13]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+也可調(diào)控自噬[14]。

金黃色葡萄球菌是一種兼性胞內(nèi)病原體，可入侵多種類型的宿主細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞，是奶牛乳腺炎的主要致病菌，其分泌的多種毒力因子在菌體逃逸宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)中起重要作用，最終與宿主細(xì)胞共生[15]。有研究表明，金黃色葡萄球菌可通過小菌落突變的表型轉(zhuǎn)換，使菌體生長(zhǎng)緩慢，毒力因子表達(dá)減少，新陳代謝速度減慢，從而不致引起強(qiáng)烈的宿主細(xì)胞反應(yīng)，使得抗生素類藥物難以將其清除[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)黏附作用相關(guān)因子如Agr的金黃色葡萄球菌能抑制自噬體成熟，這有利于金黃色葡萄球菌從自噬體逃逸至細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡[18-20]。Mestre等[21]研究表明，α-溶血素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，但并不能將LC3蛋白招募到含有細(xì)菌的自噬體中，這是一條非經(jīng)典的自噬途徑。施嵐等[22]研究發(fā)現(xiàn)，PVL S組分LukS-PV在AML細(xì)胞THP-1和HL-60中通過下調(diào)SET8抑制細(xì)胞增殖。葡萄球菌殺白細(xì)胞素，尤其是PVL，可導(dǎo)致人骨髓白細(xì)胞溶解，特別是最成熟的髓源性白細(xì)胞[23]?？梢娊瘘S色葡萄球菌及其產(chǎn)生的毒素可從多方面對(duì)宿主細(xì)胞的生存造成威脅。

Beclin1蛋白對(duì)于自噬的啟動(dòng)不可或缺，其可與 PI3KC3 形成復(fù)合物，參與自噬體形成與成熟；ATG5復(fù)合物和LC3負(fù)責(zé)協(xié)同啟動(dòng)自噬體膜的延伸，在自噬體逐步成熟過程中，LC3Ⅱ蛋白也會(huì)穩(wěn)定存在于自噬體膜上；p62是一種選擇性自噬接頭蛋白，可與LC3Ⅱ直接結(jié)合并被自噬體包裹降解，通?？梢酝ㄟ^p62蛋白表達(dá)的降低和 LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的升高判斷細(xì)胞自噬是否被激活[24]。Shaukat等[25]研究表明，金黃色葡萄球菌在RAW264.7細(xì)胞中可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

本研究中，使用產(chǎn)PVL金黃色葡萄球菌和ΔPVL金黃色葡萄球菌感染BMECs后，細(xì)胞自噬體熒光強(qiáng)度極顯著升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照，說明金黃色葡萄球菌可加劇BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及自噬。陸娟等[8]使用表達(dá) PVL 的MRSA(MRSAPVL+)和不表達(dá) PVL的MRSA(MRSAPVL-)感染人THP-1 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MRSAPVL+對(duì)THP-1細(xì)胞的P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制作用更強(qiáng)，可促進(jìn)ATG12/ATG7/ATG5自噬通路活化，增加THP-1細(xì)胞自噬;同時(shí)，MRSAPVL+誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞ROS增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)PVL金黃色葡萄球菌和PVL基因缺失金黃色葡萄球菌均能引起B(yǎng)MECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬，但是產(chǎn)PVL金黃色葡萄球菌引起的BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的效應(yīng)顯著強(qiáng)于PVL基因敲除株，且rPVL處理也可顯著上調(diào)BMECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，該結(jié)果與陸娟等[8]的研究結(jié)果相似，證實(shí)PVL的表達(dá)可以增強(qiáng)金黃色葡萄球菌的毒力。