陳 成，王 依，宋思言，楊 勇，萬春雁，閻永齊

(1 江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400；2 西安市閻良區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西 西安 710089)

獼猴桃為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl.)植物，是我國重要的本土果樹。獼猴桃于20世紀(jì)初開始人工馴化，是20世紀(jì)人工馴化最成功的果樹之一。獼猴桃果實(shí)酸甜爽口，香氣濃郁，富含維生素C、膳食纖維等多種營養(yǎng)成分，且具有低卡路里特征[1]，深受消費(fèi)者喜愛。同時，果實(shí)色澤是果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，且是果實(shí)商品價值的重要組成部分，其變化通常因葉綠素、類胡蘿卜素、花青素等色素物質(zhì)成分的組成比例不同而致。獼猴桃屬有54種、21個變種，共計75個分類單元，且果肉顏色不盡相同[2]。就生產(chǎn)而言，栽培品種大致可以分為2類，一類是果肉黃色或果心紅色的中華獼猴桃，另一類是果肉綠色的美味獼猴桃[3]?，F(xiàn)階段，對中華獼猴桃果實(shí)品質(zhì)、果肉色澤的生理和分子層面研究較深[4-6]，而對綠肉獼猴桃相關(guān)研究較少。有研究表明，葉綠素存在于眾多植物器官包括未成熟的果實(shí)中，當(dāng)果實(shí)成熟時，果肉中的葉綠素通常會被降解[7]。而海沃德獼猴桃為典型的綠肉獼猴桃品種，果實(shí)成熟后仍有大量葉綠素存留在果肉中。因此，探明海沃德獼猴桃果實(shí)葉綠素代謝機(jī)制，既是果實(shí)品質(zhì)改良的基礎(chǔ)，也對栽培技術(shù)改良和科學(xué)管理有重要意義。

套袋是世界公認(rèn)的人工干預(yù)果實(shí)接受光照的一種有效技術(shù)措施，可以有效地改善果實(shí)色澤，現(xiàn)已在果樹生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。眾多研究表明，套袋可以提高果面光潔度，改善果實(shí)的外觀品質(zhì)和內(nèi)在品質(zhì)[8-9]。在獼猴桃果實(shí)研究方面，套袋處理對改善果實(shí)外觀品質(zhì)、降低農(nóng)藥污染和提高果實(shí)商品性等具有明顯作用[10-11]。本研究以海沃德獼猴桃為試材，采用外黃內(nèi)黑單層袋、外黃內(nèi)黑雙層袋、白色單層袋、黃色條紋單層袋4種類型果袋進(jìn)行果實(shí)套袋處理，測定并分析不同處理獼猴桃果實(shí)外觀品質(zhì)、內(nèi)在品質(zhì)、糖含量、果皮與果肉色澤變化、果實(shí)葉綠素含量與葉綠素代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況，以期為解析光照對獼猴桃果實(shí)品質(zhì)及葉綠素代謝機(jī)制的影響奠定基礎(chǔ)，并為江蘇丘陵地區(qū)獼猴桃產(chǎn)業(yè)升級和經(jīng)濟(jì)效益提升提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為樹齡4年的海沃德獼猴桃，定植于江蘇省鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院華陽園獼猴桃種植基地內(nèi)，其砧木為美味獼猴桃實(shí)生苗。株行距2.8 m×3.0 m，南北行走向，大棚架種植。于盛花期后30 d，用4種類型果袋進(jìn)行果實(shí)套袋處理，具體設(shè)計為：外黃內(nèi)黑單層袋(處理A)、外黃內(nèi)黑雙層袋(處理B)、白色單層袋(處理C)、黃色條紋單層袋(處理D)，每種果袋隨機(jī)套300個果實(shí)，以不套袋作為對照(CK)。于果實(shí)成熟后收獲，立即測定相關(guān)指標(biāo)并在液氮保護(hù)下研磨，-80 ℃儲存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 獼猴桃果實(shí)外觀品質(zhì)測定 于果實(shí)采摘后用游標(biāo)卡尺測量果實(shí)縱徑、橫徑及側(cè)徑；用電子天平稱量果實(shí)單果質(zhì)量。

1.2.2 獼猴桃果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)測定 于果實(shí)達(dá)可食狀態(tài)時，測定果實(shí)品質(zhì)。果實(shí)可溶性固形物含量、總酸含量及固酸比使用手持式糖酸一體機(jī)(ATAGO，PAL-BX/ACID 8，日本)測定，果實(shí)干物質(zhì)含量用烘干法測定，結(jié)果均以各指標(biāo)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示；果實(shí)硬度使用數(shù)顯式水果硬度計(GY-4，浙江托普)測定。

1.2.3 獼猴桃果實(shí)糖含量測定 果實(shí)蔗糖、果糖及葡萄糖含量參照Chen等[12]的方法，利用氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)技術(shù)測定。

1.2.4 獼猴桃果皮和果肉色澤指標(biāo)測定 使用可攜式色差計(柯尼卡美能達(dá)，CR-400，日本)D65光源測定果皮及果實(shí)橫切面果肉(圖1)的L值(光澤明亮度)、a值(紅綠色差指標(biāo))、b值(黃藍(lán)色差指標(biāo))，以白板校正。每個處理測定5個果實(shí)，重復(fù)3次取平均值。根據(jù)a、b值計算綜合色差指標(biāo)色澤飽和度(C*)、色澤比(h)、色度角(h*)，其中C*=(a2+b2)1/2，h=a/b，h*=arc[tan(b/a)]。

圖1 不同套袋處理海沃德果實(shí)果皮(Ⅰ)和果肉橫切面(Ⅱ)

1.2.5 獼猴桃果實(shí)葉綠素含量測定 果實(shí)葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量使用葉綠素(Chlorophyll)檢測試劑盒法(微板法)(TP1051，北京雷根)測定。

1.2.6 葉綠素代謝相關(guān)基因的實(shí)時熒光定量PCR 從TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥葉綠素合成和降解相關(guān)基因的蛋白序列，與獼猴桃本地蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://kiwifruitgenome.org/organism/5)進(jìn)行比對，獲得獼猴桃葉綠素合成和降解同源基因(表1)。

表1 獼猴桃葉綠素合成和降解的相關(guān)基因信息

使用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒(Sangon Biotech)提取獼猴桃果實(shí)RNA，采用Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)第一鏈合成試劑盒(翌圣生物科技，上海)反轉(zhuǎn)錄RNA獲得cDNA,用于qRT-PCR。根據(jù)熒光定量引物設(shè)計原則，使用PrimerQuest Tool(http://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)設(shè)計引物，優(yōu)先選擇靠近基因3′端的引物(表2)，以EF1α為內(nèi)參基因。使用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus)試劑盒(翌圣生物科技，上海)進(jìn)行熒光定量檢測，定量儀器為AB-7500 (Applied biosystems 7500)。實(shí)時熒光定量條件為：預(yù)變性溫度95 ℃，時間5 min；變性溫度95 ℃，時間10 s，退火/延伸溫度60 ℃，時間30 s，共計40個循環(huán)。熔解曲線條件為儀器默認(rèn)值，使用2-ΔΔCt法對表達(dá)量進(jìn)行分析[13-14]。

表2 獼猴桃葉綠素代謝相關(guān)基因的實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增引物及其序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 16.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計和相關(guān)性分析，用one-way ANOVA方法對每個變量進(jìn)行Turkey檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 套袋對獼猴桃果實(shí)品質(zhì)的影響

由表3可知，不同套袋處理對海沃德獼猴桃果實(shí)縱徑、橫徑、側(cè)徑及單果質(zhì)量的影響均不顯著。處理A、B果實(shí)縱徑及單果質(zhì)量較其他處理小，處理C果實(shí)縱徑及單果質(zhì)量最大，處理D果實(shí)橫徑最大，CK處理果實(shí)側(cè)徑最大。

表3 不同套袋處理對海沃德果實(shí)外觀品質(zhì)的影響

由表4可知，不同套袋處理對海沃德獼猴桃果實(shí)可溶性固形物含量的影響均不顯著，果實(shí)的可溶性固形物含量以CK最高，達(dá)16.28%，以處理C最低，僅有15.43%。果實(shí)總酸含量以處理D最低，僅有0.28%，顯著低于處理C和CK。果實(shí)固酸比以處理D最高，達(dá)57.29，顯著高于處理C和CK。果實(shí)硬度以處理C最高，達(dá)1.68 kg/cm2，顯著高于其他處理，其余各處理果實(shí)硬度均在1 kg/cm2以下。不同套袋處理對海沃德獼猴桃果實(shí)干物質(zhì)含量的影響均不顯著，以處理D果實(shí)的干物質(zhì)含量最低，僅有17.44%。

由圖2可知，套袋處理可以顯著降低果實(shí)蔗糖含量，A、B、C、D 4個處理分別較CK降低了63.28%，36.85%，66.50%和51.52%。果實(shí)果糖含量以處理A最低，僅有86.42 mg/g，顯著低于處理B和CK；以處理B最高，達(dá)105.14 mg/g，顯著高于處理A和D。果實(shí)葡萄糖含量以處理A最低，僅有124.37 mg/g，顯著低于處理B、C和CK；以處理B最高，達(dá)147.20 mg/g，顯著高于處理A和D。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示經(jīng)Turkey多重比較差異顯著(P<0.05),下同

2.2 套袋對獼猴桃果實(shí)色澤的影響

不同套袋處理海沃德果皮及果肉色素指標(biāo)的變化情況如圖3所示。

圖3 不同套袋處理對海沃德果皮及果肉色素指標(biāo)的影響

由圖3可知，就果皮而言，L值以處理B最高，顯著高于處理C和CK。a值以處理B最高，顯著高于處理C、D和CK；以處理C最低，僅有8.79，顯著低于處理A和B。b值以處理B最高，達(dá)24.69，顯著高于處理C、D和CK；以CK最低，僅有19.81，顯著低于其他處理。套袋處理對C*值的影響與b值較為一致，以處理B最高，顯著高于處理C、D和CK；以CK最低，顯著低于處理A、B和D。h值以處理C最低，僅有0.40，顯著低于處理A、B和CK；以CK最高，達(dá)0.49，顯著高于處理B、C和D。h*值以處理C最高，達(dá)68.28，顯著高于處理A、B和CK。就果肉而言，套袋處理對L值的影響與果皮較為一致，即處理A、B的L值顯著高于處理C和CK；套袋處理對果肉a和h值的影響較為一致，處理A、B的a和h值為正值，處理C、D、CK的a和h值均為負(fù)值；套袋處理對果肉b和C*值的影響較為一致，處理A、B、D的b值和C*值均顯著低于處理C和CK；與C*值類似，處理A、B、D的h*值顯著低于處理C和CK。

2.3 套袋對獼猴桃果實(shí)葉綠素含量的影響

由圖4可知，獼猴桃果實(shí)葉綠素a含量以CK處理最高，達(dá)4.48 mg/g，顯著高于其他處理；以處理B最低，其與處理A差異不顯著，但顯著低于其他處理，較CK降低了93.20%。果實(shí)葉綠素b含量以CK處理最高，其與處理C差異不顯著，但顯著高于處理A、B和D；以處理B最低，僅有0.27 mg/g，顯著低于其他處理，較CK降低了88.57%。果實(shí)總?cè)~綠素含量以CK處理最高，達(dá)6.82 mg/g，顯著高于其他處理；以處理B最低，僅有0.57 mg/g，顯著低于其他處理，較CK降低了91.60%。

圖4 不同套袋處理對海沃德果實(shí)葉綠素含量的影響

2.5 套袋對獼猴桃果實(shí)葉綠素代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步研究套袋對果實(shí)顏色變化影響的相關(guān)機(jī)制，采用實(shí)時熒光定量PCR分析海沃德獼猴桃果實(shí)葉綠素合成和降解途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，結(jié)果見圖5和6。

圖5 不同套袋處理對海沃德果實(shí)葉綠素合成基因相對表達(dá)量的影響

由圖5可知，果實(shí)葉綠素合成基因AdCAO的表達(dá)豐度以處理C最低，且顯著低于其他處理。AdRBCS1和AdRBCS2的表達(dá)豐度均以處理C最高，且顯著高于其他處理。AdGLUTR1、AdGLU-TR2、AdGLUTR3的表達(dá)豐度均以處理D最高，其中處理DAdGLUTR1、AdGLUTR3的表達(dá)豐度顯著高于其他處理，AdGLUTR2、AdGLUTR3的表達(dá)豐度均以處理C最低，且顯著低于其他處理。

由圖6可知，果實(shí)葉綠素降解基因AdCBR1的表達(dá)豐度以處理D最高，且顯著高于其他處理，而其他處理之間AdCBR1表達(dá)豐度差異不顯著。AdCBR2基因的表達(dá)豐度也以處理D最高，雖顯著高于處理C，但與其他處理差異不顯著。AdCBR3的表達(dá)豐度以處理C最低，且顯著低于其他處理，而其他處理之間AdCBR3表達(dá)豐度差異不顯著。AdPAO的表達(dá)豐度以處理D最高，顯著高于處理A、B、C，但與CK差異不顯著。AdSGR1的表達(dá)豐度以處理C最高，且顯著高于其他處理。AdSGR2的表達(dá)豐度以CK處理最高，顯著高于處理B、C、D，但與處理A差異不顯著。AdPPH1、AdPPH2、AdPPH3的表達(dá)豐度均以處理D最高，其中Ad-PPH1、AdPPH3的表達(dá)豐度顯著高于除CK外的其他處理，而AdPPH2的表達(dá)豐度顯著高于其他所有處理。

圖6 不同套袋處理對海沃德果實(shí)葉綠素降解基因相對表達(dá)量的影響

3 討論與結(jié)論

隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及居民生活水平的提高，消費(fèi)者更加看重果品優(yōu)質(zhì)、綠色、安全等特征，果實(shí)套袋是果樹優(yōu)質(zhì)高效安全生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，并在果樹栽培中大面積推廣應(yīng)用[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同套袋處理對海沃德獼猴桃果實(shí)縱徑、橫徑、側(cè)徑及單果質(zhì)量的影響并不顯著，說明套袋處理并未顯著降低果實(shí)大小及單果質(zhì)量，在對蘋果[18]、梨[19]、毛花獼猴桃[20]等的相關(guān)研究中也得到了類似的結(jié)論。本研究還表明，不同套袋處理對海沃德獼猴桃果實(shí)可溶性固形物含量及干物質(zhì)含量無顯著影響；韓飛等[21]的研究表明，套袋處理可以促進(jìn)‘金艷’獼猴桃提前成熟，但不同套袋處理對‘金艷’獼猴桃軟熟時的可溶性固形物含量影響不同；而對‘紅陽’獼猴桃而言，有研究表明，套袋處理顯著降低了‘紅陽’獼猴桃果實(shí)的可溶性固形物含量[22]；說明套袋處理對不同品種獼猴桃果實(shí)品質(zhì)的影響程度不同。果實(shí)中糖的種類及其比例直接關(guān)系到果實(shí)的甜度和風(fēng)味，本研究測定不同套袋處理海沃德果實(shí)的蔗糖、果糖及葡萄糖含量，發(fā)現(xiàn)不同套袋處理對獼猴桃果實(shí)蔗糖含量的影響較大，CK處理果實(shí)的蔗糖含量顯著高于其他套袋處理，這與常曉曉等[23]報道的有機(jī)肥+套袋處理蘋果桃果實(shí)蔗糖含量顯著低于有機(jī)肥處理的結(jié)果相符。本研究表明，處理B果實(shí)的蔗糖含量顯著高于處理A、C和D，果糖和葡萄糖含量顯著高于A和D，由此可知，雙層袋處理較單層袋更有助于果實(shí)各類糖分的積累。

套袋處理后，果實(shí)表面可以避免陽光直射造成灼傷和果面顏色不均勻，果實(shí)外觀色澤鮮艷。在本研究中，套袋處理對獼猴桃果皮及果肉色澤均有很大影響。在色澤參數(shù)測定中，處理A、B、D果實(shí)的L值較高，即果面亮度高，而處理D和CK則果面暗淡。處理C、D和CK果肉的a值和h值為負(fù)值，果肉顏色表現(xiàn)為綠色，且處理C和CK果實(shí)a值和h值的絕對值大，果肉較處理D更綠。處理C和CK果肉的b值和C*值顯著高于其他處理，說明白色單層袋和不套袋處理的果肉顏色更加鮮明。葉綠素和類胡蘿卜素均是果實(shí)色澤組成的重要成分，在辣椒[24]、胡蘿卜[25]及甜橙[26]中，果實(shí)變黃是由類胡蘿卜素含量增加引起的。但是，在獼猴桃果實(shí)中，有研究認(rèn)為，中華獼猴桃果實(shí)成熟后變黃是由于果實(shí)葉綠素的消失，而不是果實(shí)類胡蘿卜素含量增加所致[27]。因此，本試驗(yàn)重點(diǎn)研究了套袋對獼猴桃果實(shí)葉綠素含量的影響，結(jié)果表明，處理C和CK果實(shí)的葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量均顯著高于其他處理，說明與白色單層袋和不套袋處理相比，套深顏色袋和雙層套袋處理均能顯著降低果實(shí)的葉綠素含量。

果實(shí)葉綠素含量由其生物合成和降解之間的平衡決定，并且受遺傳和環(huán)境的調(diào)控[28]。在本研究中，CK果實(shí)中AdCAO的表達(dá)豐度顯著高于其他處理，暗示套袋處理使得其生物合成途徑受到抑制[7]。而處理C果實(shí)中AdRBCS1的表達(dá)豐度顯著高于其他處理，可能暗示白色單層袋處理有利于AdRBCS1表達(dá)量的提高。PPH蛋白為葉綠素降解代謝的關(guān)鍵酶[29]。有研究表明，綠肉獼猴桃和黃肉獼猴桃果實(shí)中，葉綠素降解基因PPH的表達(dá)模式相似，表明美味獼猴桃和中華獼猴桃果肉色澤的差異并不是PPH表達(dá)差異導(dǎo)致的[7]。在本研究中，處理D果實(shí)中AdPPH1、AdPPH2及AdPPH3的表達(dá)豐度均最高，其中，處理D 的AdPPH1表達(dá)豐度顯著高于處理A、B及C，AdPPH2的表達(dá)豐度顯著高于其他處理，表明黃色條紋單層袋處理有利于AdPPH表達(dá)量的提高，尤其是AdPPH2可能參與了葉綠素降解過程。這些葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)豐度的降低及降解相關(guān)基因表達(dá)豐度的提高，可能是導(dǎo)致套袋果實(shí)葉綠素降解的主要原因。

綜上所述，套袋處理對海沃德獼猴桃果實(shí)大小、單果質(zhì)量、可溶性固形物含量、干物質(zhì)含量等果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)的影響并不顯著；果實(shí)蔗糖含量顯著降低，從而改變了果實(shí)糖組分所占比例；果皮及果肉顏色明顯變化，葉綠素含量降低；同時套袋處理導(dǎo)致果實(shí)葉綠素合成相關(guān)基因AdCAO表達(dá)豐度顯著下調(diào)，黃色條紋單層袋處理導(dǎo)致降解相關(guān)基因AdCBR1、AdPPH2表達(dá)豐度顯著上調(diào)。