張淑紅，高鳳菊，武秋穎，張運(yùn)峰，范永山

(唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系 唐山市農(nóng)業(yè)病原真菌與毒素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063000)

玉米大斑病是一種嚴(yán)重威脅玉米生產(chǎn)的真菌性病害，在全球溫濕地域的玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，發(fā)生嚴(yán)重年份感病品種減產(chǎn)可達(dá)50%左右[1]。生產(chǎn)上玉米大斑病主要依賴抗病基因育種防治，目前應(yīng)用的抗病基因主要是受單基因控制的Ht1、Ht2、Ht3和HtN，分別位于玉米染色體2.07，8.05，7.04和 8.06 區(qū)[2-5]。攜帶不同Ht基因的玉米基因型與玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)不同生理小種之間存在特異性互作。寄主選擇性是玉米大斑病菌與玉米之間特異性互作的決定因素。在前期研究中，F(xiàn)an等[6]發(fā)現(xiàn)玉米大斑病的發(fā)生依賴于玉米大斑病菌產(chǎn)生的HT-毒素。HT-毒素是在玉米大斑病菌培養(yǎng)濾液中發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)熱穩(wěn)定、非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物[7]。研究發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌不同生理小種間的致病性差異與HT-毒素不同毒性組分的生物學(xué)活性有關(guān)[8-10]。但是，對(duì)玉米大斑病菌HT-毒素中寄主選擇性組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物合成過(guò)程至今尚未明確[11]。

寄主選擇性毒素(HST)是植物病原真菌產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，其對(duì)寄主種類或栽培品種具有特異的生理活性和高度?；?，是決定致病性的重要因素[12-13]。自1933年Tanaka等[14]從梨的菊池鏈格孢菌(Alternariakikuchiana)上發(fā)現(xiàn)第一個(gè)HST以來(lái)，已報(bào)道植物病原真菌13個(gè)屬的27個(gè)種(或小種或?qū)；?都可以產(chǎn)生HST，其中16種HST的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定[15-17]。本研究從玉米大斑病菌次生代謝產(chǎn)物合成基因簇中，發(fā)現(xiàn)與交鏈鏈格孢(Alternariaalternata)寄主選擇性毒素ACT-毒素合成酶基因高度同源的基因簇Cluster 397.3，通過(guò)比較Cluster 397.3基因簇組成基因在玉米大斑病菌接種不同時(shí)間和不同生理小種菌株間的表達(dá)差異，分析其在病菌寄主選擇方面的可能功能和作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步明確玉米大斑病菌寄主選擇性毒素的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和玉米自交系

玉米大斑病菌23號(hào)生理小種01-23菌株和1號(hào)生理小種01-11菌株，以及玉米感病自交系B37，均來(lái)自唐山市農(nóng)業(yè)病原真菌與毒素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 玉米大斑病菌Cluster 397.3的結(jié)構(gòu)分析

利用antiSMASH技術(shù)[18]分析玉米大斑病菌23號(hào)生理小種et28a菌株的次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，利用玉米大斑病菌基因組JGI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://mycocosm.jgi.doe.gov)進(jìn)行Synteny共線性分析，獲得HST生物合成基因簇Cluster 397.3，利用Blastp分析該基因簇的基因組成，利用antiSMASH技術(shù)的KnownClusterBlast(https://fungismash.secondarymetabolites.org)功能分析該基因簇與已知基因簇的同源性;利用MSA(multiple sequence alignment)分析推測(cè)HST生物合成基因StACTTS3的功能；利用MEGA 11.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)域，利用TBtools軟件(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)可視化制圖。

1.3 玉米大斑病菌Cluster 397.3的表達(dá)分析

將玉米大斑病菌23號(hào)生理小種01-23和1號(hào)生理小種01-11菌株在PDA平板培養(yǎng)基上28 ℃靜置培養(yǎng)5 d，取直徑為9 mm的菌盤(pán)，接種4～6葉期B37玉米葉片，以菌盤(pán)的菌絲面接觸玉米葉片，保濕48 h后去除菌盤(pán)，按照常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理。分別于接種3，5，7，10 d，取接種部位葉片，在30 s內(nèi)置于液氮中速凍，3 d內(nèi)送交上海偉寰生物科技有限公司進(jìn)行RNA提純、反轉(zhuǎn)錄和高通量測(cè)序，制備RNA-Seq轉(zhuǎn)錄文庫(kù)。為了保證分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量，去除接頭污染Reads和低質(zhì)量Reads后，得到質(zhì)量較高的Clean Reads。從RNA-Seq轉(zhuǎn)錄文庫(kù)中篩選HST生物合成基因簇基因，以β微管蛋白為內(nèi)參，獲得各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用prism軟件[19]測(cè)算各基因的相對(duì)表達(dá)量并制圖，對(duì)不同侵染時(shí)間和不同小種菌株間進(jìn)行單因素ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米大斑病菌HST生物合成基因簇的基因組成

利用antiSMASH技術(shù)分析玉米大斑病菌23號(hào)生理小種et28a菌株的基因組DNA，共發(fā)現(xiàn)48個(gè)次生代謝產(chǎn)物合成基因簇。利用玉米大斑病菌基因組JGI數(shù)據(jù)庫(kù)與交鏈鏈格孢進(jìn)行Synteny共線性分析，發(fā)現(xiàn)位于scaffold_9:1 695 105-1 735 028(39 924 bp)的Cluster 397.3基因簇與交鏈鏈格孢ACT-毒素合成基因簇(scaffold_21:760 959-776 667)有保守的共線性關(guān)系(圖1-A、圖1-C)。

Cluster 397.3基因簇含有9個(gè)基因(圖1-A)：1個(gè)氨基甲酰磷酸合成酶基因(carbamoyl phosphate synthetase,CPS)、2個(gè)細(xì)胞色素P450基因(cytochrome P450，P450)、1個(gè)短鏈脫氫酶/還原酶基因(short-chain dehydrogenase/reductase,SDR)、1個(gè)鋅結(jié)合氧化還原酶基因(zinc binding dehydrogenase,ZOR)、2個(gè)耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(drug resistance transporter，DRT)、1個(gè)聚酮合酶基因(polyketide synthase，PKS)和1個(gè)保守假定蛋白編碼基因(conserved hypothetical protein，CHP)。

A.玉米大斑病菌et28a菌株；B.玉米大斑病菌ny001菌株；C.交鏈鏈格孢；D.蕓薹生鏈格孢；E.殼二孢疫病病菌；F.玉米小斑病菌；CPS.氨基甲酰磷酸合成酶基因；P450.細(xì)胞色素P450基因；SDR.短鏈脫氫酶/還原酶基因；ZOR.鋅結(jié)合氧化還原酶基因；DRT.耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；PKS.聚酮合酶基因；CHP.保守假定蛋白編碼基因

KnownClusterBlast(https://fungismash.secondarymetabolites.org)分析表明，Cluster 397.3基因簇與BGC0001264 Betaenone A/C生物合成基因簇有37%的相似性，而B(niǎo)etaenone A/C與鏈格孢(Alternariasp.)真菌產(chǎn)生的含EDA(epoxy-decatrienoic acid)結(jié)構(gòu)的HST具有一定的結(jié)構(gòu)相似性。推測(cè)Cluster 397.3基因簇也可能負(fù)責(zé)合成一種類似EDA結(jié)構(gòu)的HST。

2.2 玉米大斑病菌Cluster 397.3基因簇的Synteny分析

Synteny共線性分析發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌1號(hào)生理小種ny001菌株的Cluster 397.3同源基因簇scaffold_74:18 138―57 965也含有9個(gè)基因，與et28a菌株相同(圖1-B)。

Synteny共線性分析得到交鏈鏈格孢、蕓薹生鏈格孢(Alternariabrassicicola)、殼二孢疫病病菌(Ascochytarabiei)以及玉米小斑病菌(Cochliobolusheterostrophus)菌株的Cluster 397.3同源基因簇(圖1-C-F)。其中，交鏈鏈格孢、蕓薹生鏈格孢和殼二孢疫病病菌的Cluster 397.3同源基因簇中均包括玉米大斑病菌et28a菌株Cluster 397.3基因簇中的5個(gè)基因,分別為2個(gè)細(xì)胞色素P450基因(P450)、1個(gè)短鏈脫氫酶/還原酶基因(SDR)、1個(gè)聚酮合酶基因(PKS)和1個(gè)鋅結(jié)合氧化還原酶基因(ZOR)。而玉米小斑病菌菌株的Cluster 397.3同源基因簇僅包括其中3個(gè)基因，與上述3種菌株相比，缺少1個(gè)細(xì)胞色素P450基因和1個(gè)短鏈脫氫酶/還原酶基因(圖1-F)。

此外，在玉米大斑病菌基因組內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了交鏈鏈格孢ACTTS4、ACTT5和ACTT6的同源基因，其中玉米大斑病菌ACTTS4(StACTTS4)基因位于scaffold_4:334 954―338 493，編碼的非核糖體肽合成酶具有α氨基乙二酸還原酶活性；StACTT5編碼一種?；o酶A 合成酶(acyl-CoA synthetase)；StACTT6編碼一種烯酰輔酶A水合酶(enoyl-CoA hydratase)；它們共同參與合成HST的EDA結(jié)構(gòu)。

2.3 玉米大斑病菌Cluster 397.3 的結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)Blastp分析發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌et28a菌株的PKS基因(scaffold_9:1 708 392-1 717 224)為ACTTS3同源基因，ACTTS3是ACT-毒素合成酶關(guān)鍵基因[15],ACTTS基因是鏈格孢菌橘致病型(Alternariaalternatatangerine pathotype)特有基因。ACTTS3編碼一種聚酮合酶,玉米大斑病菌ACTTS3(StACTTS3)編碼的聚酮合酶包括6個(gè)典型結(jié)構(gòu)域，分別為聚酮合酶β-酮脂酰合成酶結(jié)構(gòu)域(polyketide synthase,β-ketoacyl synthase domain，PksD；4-1 046)、聚酮合酶脫水酶(polyketide synthase dehydratase，PS-DH；945-1 249)、甲基轉(zhuǎn)移酶-12(methyltransferase type 12，Methyltransf_12；1 427-1 528)、聚酮合酶酮還原酶(polyketide synthase,ketoreductase，PKS_KR；2 122-2 298)、脂肪酰基輔酶A還原酶NAD結(jié)合域(fatty acyl-coenzyme A reductase,NAD-binding domain，PKS_NbtC superfamily；2 126-2 477)、NAD結(jié)合Rossmann超家族(NAD-binding Rossman superfamily，NADB_Rossmann superfamily；2 583-2 870)。et28a和ny001菌株的聚酮合酶結(jié)構(gòu)域排列無(wú)差異(圖2)。

圖2 玉米大斑病菌StACTTS3的結(jié)構(gòu)域分析

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果(圖3)表明，玉米大斑病菌StACTTS3與根內(nèi)生真菌(Colletotrichumtofiel-diae)親緣關(guān)系最近，其結(jié)構(gòu)域分布完全相同。鏈格孢不同種之間以及同種不同菌株之間，StACTTS3編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域種類和分布均不同，交鏈鏈格孢D9N1A1.1有4種結(jié)構(gòu)域，交鏈鏈格孢AFN68297.1和極細(xì)鏈格孢菌RYN28010.1均有5種結(jié)構(gòu)域，但結(jié)構(gòu)域種類不同，而巴恩斯鏈格孢XP038783203.1有7種結(jié)構(gòu)域(圖2)。

圖3 玉米大斑病菌StACTTS3的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 玉米大斑病菌Cluster 397.3基因簇在病菌侵染過(guò)程中的表達(dá)分析

以玉米大斑病菌接種后的玉米葉片為樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)和測(cè)序，RNA-Seq轉(zhuǎn)錄文庫(kù)數(shù)據(jù)顯示共獲得32 875 106～58 073 444 高質(zhì)量Reads，堿基Q20(Phred數(shù)值大于20的堿基占總體堿基的比例)均大于96%，Q30(Phred數(shù)值大于30的堿基占總堿基數(shù)的比例)均大于90%，GC含量為51.67%～55.21%，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較好，可以進(jìn)行下一步分析。玉米大斑病菌Cluster 397.3基因簇在病菌侵染過(guò)程中的表達(dá)分析結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5。

*、**分別表示01-11與01-23菌株間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)

*表示接種后3 d的表達(dá)量與其他時(shí)間差異顯著(P<0.05)

由圖4和圖5可知，在玉米大斑病菌接種感病玉米自交系B73葉片3，5，7，10 d后，Cluster 397.3基因簇基因均高效表達(dá)，但不同侵染時(shí)間和不同小種菌株間均存在差異。接種后第3天，Cluster 397.3基因簇的多數(shù)基因表達(dá)量顯著高于其他侵染時(shí)間，表明Cluster 397.3基因簇主要在病菌侵染初期起作用，病菌侵入可能具有刺激毒素合成的作用；玉米大斑病菌1號(hào)生理小種菌株01-11與23號(hào)生理小種菌株01-23相比，Cluster 397.3基因簇各基因的表達(dá)規(guī)律相同，但表達(dá)量存在差異。在接種后第3天，除CHP基因外，01-11菌株其他基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于01-23菌株，其中CPS、P450_1、SDR、ZOR、PKS及P450_2等6個(gè)基因的表達(dá)差異達(dá)到極顯著水平，表明Cluster 397.3基因簇的表達(dá)存在菌株特異性。

由圖4和圖5還可知，在接種第3天時(shí)，Cluster 397.3基因簇的SDR、DRT_1和ZOR基因表達(dá)量均較高，說(shuō)明在病菌侵染初期主要以氧化還原代謝反應(yīng)和功能蛋白運(yùn)輸為主；其次為P450和PKS，其中P450主要參與生物氧化，而PKS主要用于合成病菌的特異致病因子；CPS表達(dá)量較低，其在病菌侵染過(guò)程中主要負(fù)責(zé)氨基酸代謝過(guò)程中NH3的轉(zhuǎn)運(yùn)。

3 討 論

聚酮合酶是介導(dǎo)聚酮化合物生物合成的關(guān)鍵酶，廣泛存在于細(xì)菌和真菌中。聚酮化合物是一類具有廣泛生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，與微生物抗逆、分生孢子產(chǎn)生、成熟附著胞的形成、分生孢子存活、病菌毒力和致病力等密切相關(guān)[20-22]。張?chǎng)蔚萚23-24]在玉米大斑病菌基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)與黑色素合成及致病性有關(guān)的聚酮合酶基因，且該基因的表達(dá)量下降會(huì)影響 DHN黑色素的合成。本研究發(fā)現(xiàn)Cluster 397.3是一個(gè)與玉米大斑病菌HST合成有關(guān)的基因簇，該基因簇不僅含有1個(gè)聚酮合酶基因，還包含氨基甲酰磷酸合成酶、短鏈脫氫酶/還原酶、鋅結(jié)合氧化還原酶、耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞色素P450等其他8個(gè)基因。通過(guò)共線性分析發(fā)現(xiàn)，交鏈鏈格孢、蕓薹生鏈格孢、殼二孢疫病病菌和玉米小斑病菌均存在Cluster 397.3的同源基因簇，表明該基因簇具有較強(qiáng)的保守性。

利用HST接種植物材料可以判斷植物病原真菌的致病性和寄主植物的抗病性，而且HST接種比用病原真菌接種更能迅速且大量地鑒定出感病和抗病材料[25-27]，因此HST在植物抗病性鑒定和抗病育種應(yīng)用方面具有極大的優(yōu)越性。利用HST生物合成基因，還可以進(jìn)行真菌種屬及?；偷蔫b定。研制鈍化或抑制HST的化學(xué)或生物藥劑，可以開(kāi)發(fā)新型殺菌劑。某些HST是除草劑、殺蟲(chóng)劑、殺菌劑，甚至某些醫(yī)藥的重要化學(xué)成分，因此HST在農(nóng)藥和醫(yī)藥開(kāi)發(fā)方面也有重要作用[28-31]。

本研究對(duì)病菌侵染過(guò)程中的表達(dá)分析結(jié)果表明，Cluster 397.3基因簇各基因的表達(dá)在01-23(23號(hào)生理小種)和01-11(1號(hào)生理小種)菌株間存在顯著差異，推測(cè)該基因簇可能為玉米大斑病菌生理小種分化和致病特異性的關(guān)鍵基因。因此，確定Cluster 397.3為玉米大斑病菌的候選HST生物合成基因簇，該基因簇與ACT-毒素合成基因簇高度同源。

研究表明，交鏈鏈格孢ACT-毒素的作用位點(diǎn)主要在寄主的質(zhì)膜和葉綠體上，可造成細(xì)胞膜透性改變進(jìn)而引起電解質(zhì)外滲，或破壞葉綠體膜結(jié)構(gòu)而抑制光合作用[15]。本研究結(jié)果表明，玉米大斑病菌HST合成基因簇基因在病菌接種第3天時(shí)高效表達(dá)，表明HST的合成主要發(fā)生在病菌侵染初期，以破壞玉米葉片細(xì)胞和葉綠素合成為主。Miyamoto等[32]發(fā)現(xiàn)，ACT-毒素并非都引起感病反應(yīng)，它還可以作為一種激發(fā)子誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而引起抗病反應(yīng)，因此ACT-毒素具有極強(qiáng)的寄主選擇性。本研究發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌HST合成基因簇的9個(gè)基因中，除了CHP基因外，其他基因的表達(dá)量在01-11和01-23菌株間表現(xiàn)出了顯著或極顯著差異，推測(cè)HST合成基因簇的表達(dá)差異可能與病菌生理小種有關(guān)。