魏春華，黃夏玲，楊 圓，何 樂，林志鋒,2，徐 葉,2，黃文琳,柳開隆，戴愛玲，楊小燕，劉建奎

(1 龍巖學院 a生命科學學院，b福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室，c 預防獸醫(yī)學與生物技術(shù)福建省高校重點實驗室，福建 龍巖 364000;2福建農(nóng)林大學 動物科技學院，福建 福州 350002)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)于1987年首次在美國報道以來，現(xiàn)已傳播至大多數(shù)養(yǎng)豬國家，成為一種全球性的豬病毒性傳染病，給世界各國帶來巨大的經(jīng)濟損失[1-3]。目前，基于Shi等[4]Type 2 PRRSV的分類系統(tǒng)，我國的流行毒株可分為4個譜系：譜系1(NADC30-like)、譜系3(QYYZ-like)、譜系5.1(VR2332-like)、譜系8.7(JXA1-like和CH-1a)，各個譜系間毒株序列存在較大差異，其中處于譜系8.7的HP-PRRSV和譜系1的NADC30-like株是我國流行的優(yōu)勢毒株[5-6]。當前，免疫弱毒苗或滅活苗是防控PRRS的主要手段，兩種疫苗對同源性毒株均能產(chǎn)生良好的免疫效果，而對于異源性毒株交叉免疫保護作用較差。2012年國內(nèi)出現(xiàn)了NADC30-like毒株，該類毒株間基因組高度變異，易于與其他毒株包括疫苗株發(fā)生重組，導致商品化疫苗無法提供良好的免疫保護[7-9]。研究表明，PRRSV侵入后，機體主要產(chǎn)生針對病毒GP5蛋白的中和抗體，因此GP5蛋白成為研制新型疫苗的首選蛋白[10-12]。近年來，PRRSV變異速度明顯加快，導致現(xiàn)有疫苗對其交叉保護性較差，這迫切需要研制安全有效的疫苗來防控PRRS。DNA疫苗是一種極具發(fā)展前景的基因工程疫苗，可誘導細胞和體液免疫應答，成為新型疫苗的研究熱點和開發(fā)方向。

DNA改組技術(shù)(DNA shuffling)又稱有性PCR技術(shù)，可以使基因在分子水平上進行重組，從而獲得含有多個親本基因的突變體，在生物工程領(lǐng)域得到了廣泛應用，特別是在改造病毒載體、細胞因子、啟動子抗體及目的蛋白等方面顯現(xiàn)出巨大的應用潛力[13-18]。研究人員將不同譜系PRRSV的不同基因通過DNA改組成功構(gòu)建出具有感染性的嵌合病毒，動物試驗證實嵌合病毒能對異源毒株產(chǎn)生良好的交叉保護作用[16-18]。目前，PRRSV毒株多且弱毒疫苗株與野毒株頻頻發(fā)生重組，導致現(xiàn)有疫苗不能有效預防PRRS，因此本研究利用DNA 改組技術(shù)對不同譜系PRRSV的ORF5基因進行重組構(gòu)建DNA疫苗，以期對異源性毒株產(chǎn)生良好的交叉保護效果，為進一步研發(fā)安全、有效的PRRSV DNA重組疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、毒株及主要試劑

pCAGGS-HA(pCA-HA)載體質(zhì)粒、pCA-ORF5-MLV(ORF5基因來自疫苗株Ingelvac PRRS MLV)質(zhì)粒，以及PRRSV譜系1毒株FJ-Chen、FJ-Huang和FJ-Yang(GenBank登錄號分別為MZ322854、MZ322857、MZ322861)、譜系3毒株FJ-Deng和FJ-Liu(GenBank登錄號分別為MZ322861、MZ322858)、譜系5.1毒株FJ-Wang(GenBank登錄號為MZ322860)、譜系8.7毒株FJ-Qiu和FJ-Fu(GenBank登錄號分別為MZ322859、MZ322856))和MARC-145細胞，均由福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室保存；小鼠抗HA一抗，購自北京義翹神州科技有限公司；Lp8000轉(zhuǎn)染試劑盒、ECL超敏發(fā)光試劑盒及HRP標記的羊抗鼠IgG、Cell Counting Kit(CCK8)，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；山羊抗鼠IgG熒光抗體(FITC標記)，購自美國Sigma公司；弱毒活疫苗Ingelvac PRRS MLV，購自勃林格殷格翰動物保健(中國)有限公司；無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒，購自Omega公司；小鼠白介素4(IL-4)及干擾素γ(IFN-γ)ELISA試劑盒，購自西塘科技有限公司；PRRSV GP5蛋白抗體(PRRSV-GP5)ELISA試劑盒，購自上海潤裕生物技術(shù)有限公司；PE標記的鼠抗CD4抗體、FITC標記的鼠抗CD8抗體，購自Biolegend公司；BALB/c小鼠,購自閩侯縣吳氏實驗動物貿(mào)易有限公司。

1.2 重組突變體質(zhì)粒的構(gòu)建

按照文獻[19]的方法設計PRRSVORF5基因引物，交由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列為，P1：5′-CACTTCATGACACCTGAGAC-3′，P2：5′-AAGGCATATATCATTATTGGCGT-3′。按照文獻[19-20]的方法，利用DNA改組技術(shù)構(gòu)建重組突變體質(zhì)粒，具體過程為：提取FJ-Chen、FJ-Huang、FJ-Yang、FJ-Deng、FJ-Liu、FJ-Wang、FJ-Qiu和FJ-Fu毒株的RNA，采用RT-PCR方法擴增ORF5基因，電泳后回收PCR產(chǎn)物。對回收的PCR產(chǎn)物用DNase Ⅰ酶進行酶切，獲得多個50～100 bp的小片段，以其為模板進行無引物和有引物PCR擴增，將擴增產(chǎn)物與pMD-19T載體連接構(gòu)建重組突變體質(zhì)粒，將重組突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。挑選200個含有重組質(zhì)粒的菌落送往北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序，利用DNAStar和MEGA 6.0等生物學軟件對測序結(jié)果進行序列比對，篩選含有PRRSV 4個譜系ORF5基因的重組突變體質(zhì)粒。

1.3 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將重組突變體質(zhì)粒和真核表達載體pCAGGS-HA分別用BamH Ⅰ和XhoⅠ進行雙酶切后進行連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。提取重組表達質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后，陽性克隆交由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序鑒定。

1.4 重組質(zhì)粒在MARC-145細胞中表達的檢測

將MARC-145細胞均勻平鋪在6孔細胞培養(yǎng)板上，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng)，次日待細胞鋪滿培養(yǎng)板孔80%左右時,用Lp8000轉(zhuǎn)染試劑盒將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞，具體操作按試劑盒說明書進行。采用間接免疫熒光試驗(IFA)和Western blotting試驗(WB)對重組表達質(zhì)粒在MARC-145細胞中的表達情況進行檢測。

間接免疫熒光試驗(IFA)：向上述轉(zhuǎn)染重組表達質(zhì)粒MARC-145細胞的6孔板中,每孔放1張細胞爬片，培養(yǎng)48 h后用體積分數(shù)4%多聚甲醛固定，依次以小鼠抗HA蛋白抗體(1∶800倍稀釋)為一抗， FITC標記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 600 倍稀釋)為二抗，分別于37 ℃孵育1 h，加50 μL DAPI細胞核染色液，再于37 ℃避光孵育10 min，用TBST清洗2次(每次3 min)，PBS洗滌后以中性樹脂封片，晾干后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。試驗以未轉(zhuǎn)染目的基因的MARC-145細胞為陰性對照。

Western blotting檢測(WB)：對轉(zhuǎn)染48 h的MARC-145細胞進行收樣，加入RIPA蛋白裂解液使細胞膜溶解后，進行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜，以鼠抗HA蛋白抗體(1∶800倍稀釋)為一抗，4 ℃冰箱孵育過夜，HRP標記的山羊抗小鼠為二抗(1∶1 600 倍稀釋)，37 ℃孵育1 h，進行Western blotting檢測。試驗以未轉(zhuǎn)染目的基因的MARC-145細胞為陰性對照。

采用無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒提取重組表達質(zhì)粒(pCA-ΔORF5-8、pCA-ΔORF5-46)，即得PRRSVORF5基因DNA重組疫苗，對其純度、濃度、RNA和殘留蛋白質(zhì)進行檢測[21]。

1.5 PRRSV ORF5基因DNA重組疫苗免疫效果檢測

取48只6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，隨機分為6組，每組8只。第1組為PBS空白對照組，第2組為pCAGGS-HA空載體組，第3組為弱毒疫苗組(經(jīng)典弱毒疫苗Ingelvac PRRS MLV，MLV組)，第4組為pCA-ORF5-MLV組(ORF5基因來自Ingelvac PRRS MLV)，第5和第6組分別為pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46(本試驗構(gòu)建)組。在pCA-ORF5-MLV組、pCA-ΔORF5-8組、pCA-ΔORF5-46組和pCAGGS-HA空載體組小鼠大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射免疫相應的無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒100 μg/只，PBS空白對照組小鼠大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射PBS 100 μL/只，弱毒疫苗MLV組小鼠大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射免疫弱毒疫苗100 μL/只[22]。各組均免疫3次，每次間隔14 d。

1.5.1 血清IL-4、INF-γ、PRRSV-GP5蛋白抗體水平檢測及脾淋巴細胞增殖試驗 采集免疫前(免疫0 d)及二免后2周(42 d)和三免后2周(56 d) 6組小鼠全血，析出血清，利用小鼠IL-4和INF-γ ELISA檢測試劑盒檢測小鼠血清中IL-4和INF-γ濃度。同時使用小鼠PRRSV GP5蛋白抗體ELISA檢測試劑盒檢測小鼠血清中的GP5蛋白抗體。免疫后56 d，按照動物福利要求的方法將小鼠處死，無菌取脾分離脾淋巴細胞，用滅活PRRSV作為特異性抗原刺激脾淋巴細胞，使用CCK8法檢測小鼠脾淋巴細胞增殖水平。

1.5.2 血清中和試驗 將采集的pCA-ΔORF5-8等6組小鼠56 d的血清滅活并進行2倍倍比稀釋，分別與等體積100 倍TCID50的譜系1 FJ-Chen(病毒滴度為106.2TCID50/mL)、譜系3 FJ-Liu(病毒滴度為106.0TCID50/mL)、譜系5.1 FJ-Wang(病毒滴度為106.6TCID50/mL)和譜系8.7 FJ-Fu(病毒滴度為107.5TCID50/mL)毒株混合，采用固定病毒、稀釋血清的方法進行血清中和試驗，評價免疫小鼠血清對不同譜系PRRSV的中和能力[23]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

運用IBM SPSS statistics和Graphpad Prism等分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組突變體質(zhì)粒的篩選

利用生物學軟件DNAStar對測序結(jié)果進行分析，最終篩選出2個含有PRRSV 4個譜系部分ORF5基因(去除信號肽)的重組突變體質(zhì)粒，命名為ΔORF5-8和ΔORF5-46。利用MEGA 6.0軟件對基于核苷酸推導的氨基酸序列進行分析，結(jié)果顯示，ΔORF5-8和ΔORF5-46重組突變體均含有PRRSV 4個譜系GP5蛋白(圖1、圖2)。

2.2 重組真核表達質(zhì)粒的鑒定

重組真核表達質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切，結(jié)果切出大小約為4 800 bp的pCAGGS-HA載體片段和465 bp的重組突變體片段(圖3)，與預期結(jié)果相符。陽性克隆測序鑒定結(jié)果表明，成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46。

M.DNA Marker DL5000；1.pCA-ΔORF5-8雙酶切結(jié)果;2.pCA-ΔORF5-46雙酶切結(jié)果

2.3 重組質(zhì)粒在MARC-145細胞中的表達

將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46，轉(zhuǎn)染MARC-145細胞48 h后，進行IFA與Western blotting 分析。IFA結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pCA-ΔORF5-8重組表達質(zhì)粒的細胞能檢測到特異性綠色熒光，而正常對照細胞無特異性熒光(圖4-A)；轉(zhuǎn)染pCA-ΔORF5-46重組表達質(zhì)粒的細胞結(jié)果與轉(zhuǎn)染pCA-ΔORF5-8的細胞一致(圖略)。Western blotting結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46重組表達質(zhì)粒的細胞樣品在17 ku處出現(xiàn)目的條帶(圖4-B)。上述分析結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46可在MARC-145中有效表達。

A.pCA-ΔORF5-8 IFA結(jié)果;B.Western blotting檢測結(jié)果。1.陰性對照；2.pCA-ΔORF5-8；3.pCA-ΔORF5-46

2.4 免疫小鼠血清IL-4、INF-γ檢測

IL-4檢測結(jié)果(圖5-A)顯示，pCA-ORF5-MLV和pCA-ΔORF5-46免疫小鼠在42 d時血清IL-4水平較高，而MLV組和pCA-ΔORF5-8組在56 d時才達到相近的水平；免疫后42～56 d，pCA-ΔORF5-8組和pCA-ΔORF5-46組小鼠血清中IL-4水平極顯著高于pCAGGS-HA空載體組和PBS空白對照組(P<0.01)，而pCA-ΔORF5-8組與MLV組差異不顯著(P>0.05)。INF-γ檢測結(jié)果(圖5-B)顯示，pCA-ΔORF5-46免疫小鼠在56 d時血清IFN-γ水平最高，pCA-ΔORF5-8組和pCA-ΔORF5-46組小鼠血清IFN-γ水平極顯著高于pCAGGS-HA空載體組和PBS空白對照組(P<0.01)，與MLV組差異顯著(P<0.05)。上述結(jié)果表明，重組DNA疫苗pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46 均能誘導TH1類和TH2類細胞因子的分泌，從而提高機體的細胞及體液免疫應答水平。

圖柱上標不同小寫字母表示同類處理相比差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同

2.5 免疫小鼠血清中的PRRSV特異性中和抗體水平

在0,42和56 d分別對各組小鼠采血分離血清，使用小鼠血清PRRSV GP5蛋白抗體ELISA檢測試劑盒檢測GP5抗體水平。結(jié)果(圖6)表明，與pCAGGS-HA空載體組和PBS空白對照組相比，pCA-ΔORF5-8、pCA-ΔORF5-46、pCA-ORF5-MLV以及MLV組小鼠血清GP5抗體水平均極顯著提高(P<0.01)；與42 d相比，56 d時pCA-ΔORF5-46組小鼠血清的GP5抗體水平較高，極顯著高于弱毒疫苗MLV組，但極顯著低于pCA-ORF5-MLV組。結(jié)果表明，重組DNA疫苗pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46能刺激機體產(chǎn)生特異性抗體。

圖6 PRRSV ORF5基因DNA重組疫苗免疫小鼠血清GP5抗體檢測

2.6 免疫小鼠的淋巴細胞增殖反應

無菌取小鼠脾臟，分離脾淋巴細胞，進行脾淋巴細胞增殖試驗來評價疫苗誘發(fā)的細胞免疫應答。結(jié)果(圖7)顯示，pCA-ORF5-MLV、pCA-ΔORF5-8、pCA-ΔORF5-46和MLV組小鼠的脾淋巴細胞刺激指數(shù)(SI)極顯著高于pCAGGS-HA空載體組和PBS空白對照組(P<0.01)，表明重組DNA疫苗pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46均能提高機體的細胞免疫應答水平。

2.7 免疫小鼠產(chǎn)生的中和抗體水平

由表1可知，在第3次免疫后14 d，pCA-ΔORF5-46組小鼠能對4個譜系毒株產(chǎn)生特異性中和抗體，對譜系1代表毒株FJ-Chen、譜系3代表毒株FJ-Liu、譜系5.1代表毒株FJ-Wang、譜系8.7代表毒株FJ-Fu產(chǎn)生的中和抗體的平均滴度分別為12，11，11和16；pCA-ΔORF5-8組小鼠能對譜系1、3和8.7代表毒株產(chǎn)生較高水平的特異性中抗體，對譜系1代表毒株FJ-Chen、譜系3代表毒株FJ-Liu、譜系8.7代表毒株FJ-Fu產(chǎn)生的中和抗體平均滴度分別為16，10和12；pCA-ORF5-MLV組小鼠對譜系5.1、譜系1代表毒株產(chǎn)生了較高水平的特異性中和抗體，抗體平均滴度分別為17和11；MLV組小鼠對譜系5.1、譜系8.7代表毒株產(chǎn)生的中和抗體的平均滴度為12和9；免疫空載體pCAGGS-HA和PBS空白對照組，均不能產(chǎn)生中和抗體。結(jié)果表明，pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46能誘導機體產(chǎn)生更有效的中和抗體，尤其是對近期流行的譜系1和譜系3的代表毒株免疫效果較好。

表1 PRRSV ORF5重組基因DNA疫苗免疫小鼠血清的中和抗體滴度

3 討 論

目前，PRRS已遍布世界主要養(yǎng)豬國家和地區(qū)，成為嚴重妨礙養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的傳染病之一。目前接種PRRSV滅活疫苗和弱毒疫苗是防控PRRS的主要方式，但滅活疫苗在滅活過程中易造成抗原表位的缺失或抗原性減弱，免疫豬只后不能產(chǎn)生強有力的免疫保護，而且抗體持續(xù)時間相對較短，需要多次免疫。弱毒疫苗不能對部分異源型毒株提供保護，在免疫選擇性的壓力下可能會導致毒株變異甚至疫苗毒力返祖，導致PRRS的再次暴發(fā)[24-26]。此外，目前豬場主要流行的類NADC30株易于與減毒活疫苗株發(fā)生重組，導致商品化疫苗無法提供良好的免疫保護，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴峻挑戰(zhàn)，因此有必要研制新型安全有效的疫苗防控PRRS[7-9]?；蚬こ桃呙缡墙甑难芯繜狳c和方向，研究人員希望通過基因工程技術(shù)研發(fā)出更加安全、有效的疫苗。ORF5基因編碼的GP5蛋白作為PRRSV主要的結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的免疫原性，GP5蛋白誘導產(chǎn)生的中和抗體與免疫保護性反應最為相關(guān)，成為研制新型疫苗的首選蛋白，但是GP5蛋白是PRRSV最易變異的蛋白之一，導致一種毒株產(chǎn)生的中和抗體不能對其他異源PRRSV產(chǎn)生良好的交叉保護[27]。研究人員利用DNA 改組技術(shù)對不同亞群PRRSV的基因進行重組改造構(gòu)建嵌合病毒，經(jīng)動物實驗驗證，所構(gòu)建的 PRRSV 嵌合病毒可以誘導機體產(chǎn)生針對異源毒株的交叉中和抗體，說明DNA改組技術(shù)在開發(fā)有效的針對異源毒株保護的PRRS疫苗方面具有廣闊的應用前景[17-19]。

在PRRSV GP5 N端中和表位(PNE)上游存在一個誘騙表位區(qū)A27/V27LVN30，可以誘導機體產(chǎn)生大量的非中和抗體，延遲機體針對PNE產(chǎn)生中和抗體[28]。因此本研究選取4個譜系8株P(guān)RRSV毒株的ORF5基因，利用DNA 改組技術(shù)進行體外基因重組，去信號肽和非中和表位，篩選出2個重組突變體(ΔORF5-8和ΔORF5-46)，其氨基酸同源性為93.5%。IFA和Western blotting證實，重組表達質(zhì)粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46能在MARC-145細胞中有效表達。用2個重組DNA疫苗(pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46)免疫小鼠后，均能刺激機體產(chǎn)生特異性的GP5蛋白抗體，與弱毒活疫苗組和pCA-ORF5-MLV組相比，免疫效果相近，表明重組質(zhì)粒能刺激機體產(chǎn)生體液免疫應答。PRRSV中和抗體能夠阻止病毒在肺泡巨噬細胞中的復制，可能在病毒的清除過程中起重要作用[29]。血清中和試驗證實，2個重組DNA疫苗能刺激動物機體產(chǎn)生淋巴細胞增殖反應，并產(chǎn)生針對3～4個不同譜系尤其是譜系1和譜系3代表毒株的中和抗體，而pCA-ORF5-MLV組只能刺激機體產(chǎn)生針對譜系5.1和8.7毒株的中和抗體，表明2個重組DNA疫苗可能對異源性毒株起到交叉保護作用，但這還需要進一步通過豬只免疫保護性試驗進行驗證。

IFN-γ在機體細胞免疫中發(fā)揮著十分重要的作用，本研究中，ELISA檢測結(jié)果表明，2個重組DNA疫苗組小鼠血清中IL-4和INF-γ細胞因子顯著高于PBS空白對照組和pCAGGS-HA空載體組(P<0.05)，表明重組質(zhì)粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46均能有效誘導機體細胞免疫水平。因此本研究構(gòu)建的DNA疫苗能有效刺激并誘導機體產(chǎn)生細胞及體液免疫應答，為研發(fā)PRRS新型基因工程疫苗提供了新的思路。此外，本研究也存在不足之處，如pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46組檢測到的GP5抗體水平相對較低。研究表明，與單獨表達的疫苗相比，融合表達CTLA4或GPX1與PRRSV ORF5的靶向疫苗能夠誘導更好的免疫效果，因此后期本課題組將對重組質(zhì)粒與細胞因子共表達、DNA疫苗與弱毒苗及滅活苗聯(lián)合免疫或通過GP5-M融合表達等來提高疫苗的免疫效果[23,30-31]。此外，本研究結(jié)果是基于小鼠試驗獲得的，還不能真實客觀地評價疫苗的免疫效果，疫苗是否能在宿主豬體內(nèi)起到良好的免疫效果，尚有待進一步研究。