王偉，王聃，王曉光

1 唐山市中醫(yī)醫(yī)院普外科，河北唐山 063000；2 唐山市中醫(yī)醫(yī)院腔鏡外科

胃癌為消化道常見惡性腫瘤，2020 年中國新發(fā)和死亡病例分別為47.9 萬、37.4 萬，占全球胃癌病例總數(shù)的43.99%、48.63%［1］。目前大多胃癌患者在診斷時已經(jīng)處于進展期，且缺乏有效治療手段，還需進一步了解胃癌發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動因素。微小RNA（miRNA）是一類非編碼小RNA，通過調(diào)控癌基因與抑癌基因參與腫瘤發(fā)生和進展［2］。miR-875-5p在肝細胞癌和食管鱗狀細胞癌組織中異常表達，與癌細胞增殖、遷移和侵襲有關(guān)［3-4］。上游轉(zhuǎn)錄因子2（USF2）是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，能通過調(diào)節(jié)泛素-蛋白酶體途徑（UPP）參與乳腺癌進展［5］。目前關(guān)于miR-875-5p、USF2 與胃癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系尚不明確，本研究旨在分析胃癌組織中miR-875-5p、USF2 表達變化及其臨床意義，以期為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015 年1 月—2017 年1 月唐山市中醫(yī)醫(yī)院收治的93 例胃癌患者，其中男64 例，女29 例；年齡41～78（60.85±7.36）歲；腫瘤直徑≥5 cm 46 例，＜5 cm 47 例；組織分化程度：低分化35例，中高分化58 例；TNM 分期［6］：Ⅰ期24 例、Ⅱ期27例、Ⅲ期26 例、Ⅳ期16 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45 例。納入標準：①經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為胃癌；②初診，入院前未接受抗腫瘤治療；③接受姑息性或根治性手術(shù)；④病理特征和隨訪資料完整；⑤年齡≥18 歲；⑥患者及家屬均知情同意。排除標準：①合并其他部位腫瘤；②全身感染性疾??；③既往胃部手術(shù)史；④合并嚴重心、肝、腎功能損害。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 胃癌組織及癌旁組織中miR-875-5p、USF2 mRNA 表達檢測 采用定量RT-PCR。收集術(shù)中切除的癌組織及癌旁組織（距癌組織邊緣＞5 cm），置于液氮冷凍保存。取50 mg 組織液氮中研磨成末，加入TRIzol 試劑（北京索萊寶科技有限公司）提取組織中總RNA，TaKaRa 試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）轉(zhuǎn)錄合成cDNA，NaroDrop驗證cDNA 濃度及純度（OD260/OD280為1.8～2.0），使用定量RT-PCR 試劑盒（廣州銳博生物技術(shù)有限公司）和定量RT-PCR 儀（賽默飛世爾科技有限公司）進行擴增。miR-875-5p上游引物：5'-GCCTCATGGAATACTGTTGAACC-3'，下游引物：5′-GGATAGATCACTCTCTCACC-3'；USF2 上 游 引 物：5'-AAAGGAGGGATCCTGTCCAA-3'，下 游 引 物：5'-CAGGGCGTTCTCATTCTTCA-3'；miR-875-5p內(nèi)參U6上游引物：5'-AGAGCCTGTGGTGTCCG-3'，下游引物：5'-CATCTTCAAAGCACTTCCCT-3′；USF2 內(nèi)參GAPDH 上游引物：5'-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'，下游引物：5'-TTGAGGTCAATGAAGGGGTCA-3'。反 應(yīng) 體 系共20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、cDNA 模板2.0 μL、經(jīng)DEPC 處理水6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s 循環(huán)1 次；95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s，循環(huán)40次。用2-ΔΔCt法計算組織中miR-875-5p、USF2 mRNA相對表達量。

1.3 隨訪 所有患者出院后通過門診或電話方式隨訪，隨訪至2022 年1 月，統(tǒng)計術(shù)后5 年累積生存率，死亡或隨訪時間截至則研究結(jié)束。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS27.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗；計量資料均呈正態(tài)分布以-x±s表示，組間比較采用t檢驗；用生物學(xué)網(wǎng)站http：//www. targetscan. org/分析預(yù)測miR-875-5p 和USF2 間的相互作用位點；Pearson相關(guān)法分析胃癌組織中miR-875-5p 與USF2 mRNA表達的相關(guān)性；Kaplan-Meier 法繪制胃癌患者生存曲線，組間生存率比較采用Log-rank 檢驗；多因素Cox回歸分析胃癌患者預(yù)后的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及癌旁組織中miR-875-5p、USF2 mRNA 表達比較 胃癌組織中miR-875-5p 表達低于癌旁組織，USF2 mRNA表達高于癌旁組織（P均＜0.05）。見表1。USF2 的3'-非翻譯區(qū)595~601堿基處存在與miR-875-5p 潛在的結(jié)合位點。Pearson 相關(guān)分析顯示，胃癌組織中miR-875-5p 與USF2 mRNA表達呈負相關(guān)（r=-0.710，P＜0.05）。

表1 胃癌組織和癌旁組織中miR-875-5p、USF2 mRNA表達比較（±s）

表1 胃癌組織和癌旁組織中miR-875-5p、USF2 mRNA表達比較（±s）

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2.2 miR-875-5p、USF2 mRNA 表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 miR-875-5p、USF2 mRNA 表達與胃癌分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05）。見表2。

表2 miR-875-5p、USF2 mRNA表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 miR-875-5p、USF2 mRNA 表達與預(yù)后的關(guān)系隨訪5年，中位隨訪時間35個月，93例胃癌患者5年累積生存率為57.83%（48/83）。miR-875-5p高表達患者（≥0.903，n=50）、低表達患者（＜0.903，n=43）5年累積生存率分別為60.00%（30/50）、41.86%（18/43）；USF2 mRNA 高表達患者（≥2.606，n=45）、低表達患者（＜2.606，n=48）5 年累積生存率分別為37.78%（17/45）、64.58%（31/48）。miR-875-5p 高表達患者累積生存率高于miR-875-5p 低表達患者，USF2 mRNA 高表達患者累積生存率低于USF2 mRNA 低表達患者（P均＜0.05）。

2.4 miR-875-5p、USF2 mRNA 對胃癌患者預(yù)后的影響 以隨訪時間為時間變量，以表3單因素分析有差異因素為自變量，預(yù)后為因變量（死亡=1，存活=0），多因素Cox 回歸分析顯示，TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、USF2 mRNA≥2.606是胃癌患者死亡的獨立危險因素，miR-875-5p≥0.903 是獨立保護因素（P均＜0.05）。見表3、4。

表3 胃癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，以厭食、腹痛、飽腹感、消化不良、疲乏等為常見癥狀，但早期并無特異性癥狀，導(dǎo)致大多患者在確診時已處于進展期，發(fā)生轉(zhuǎn)移。我國70.8%的胃癌患者在確診時已存在局部進展，晚期胃癌患者5 年累積生存率不足30%［7-8］。目前胃癌的治療仍以手術(shù)為主，放化療為輔，對晚期胃癌療效較差。近年來以個體化精準化為特征的免疫和靶向治療為胃癌治療提供了新方向，但目前仍未達到滿意效果，還需進一步了解其分子機制，對判斷胃癌進展、評估預(yù)后、延長生存期具有重要意義。

表4 胃癌患者預(yù)后影響因素的多因素Cox回歸分析

人類基因組中，98%的蛋白質(zhì)為不參與蛋白質(zhì)編碼的非編碼RNA，共同組成了生物體細胞中復(fù)雜的RNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，廣泛參與腫瘤細胞各種生物學(xué)過程。miRNA 是一類內(nèi)源性長18～25 個核苷酸的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA 的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合，負向調(diào)節(jié)靶基因表達，進而參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，在腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因功能［9］。如miR-3178 能通過抑制缺口受體1（Notch1）抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲［10］。miR-875-5p 定位于人染色體8q22.2，近年多項研究均報道了其與惡性腫瘤的關(guān)系［11-12］。HE 等［11］研究報道，膀胱癌中miR-875-5p 表達上調(diào)，能通過抑制COP9 信號體7A 亞基促進癌細胞增殖。CHEN 等［12］研究報道，肝細胞癌中miR-875-5p 表達下調(diào)，能通過上調(diào)真核翻譯起始因子3a 抑制癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。上述研究表明，miR-875-5p 在不同腫瘤中作用不同。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-875-5p 表達降低，提示miR-875-5p 可能在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。眾所周知，癌細胞能通過促進增殖和抑制凋亡而無限增殖，進而促進腫瘤發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-875-5p 表達與分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，進一步提示miR-875-5p 在胃癌中發(fā)揮抑癌基因作用，其機制可能與抑制Notch3 表達有關(guān)。Notch3 是一種經(jīng)典癌基因，Notch3異常激活參與多種惡性腫瘤細胞增殖、分化、遷移等過程［13］。KANG 等［14］研究顯示，Notch3 是胃癌中表達最失調(diào)的Notch，上調(diào)miR-875-5p 表達能靶向抑制Notch3 異常激活，并提升胃癌細胞對化療的敏感性。本研究結(jié)果還顯示，miR-875-5p 高表達患者術(shù)后5 年累積生存率升高，是胃癌患者預(yù)后的獨立保護因素，說明miR-875-5p 或可成為胃癌患者預(yù)后評估指標。

UPP 是負責(zé)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要系統(tǒng)，在細胞基本細胞生命過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，目前研究表明，UPP是多種腫瘤相關(guān)調(diào)節(jié)異常的重要靶點，能通過其特殊的蛋白酶體裂解活性，上調(diào)或下調(diào)抑癌基因，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展［15-16］。USF2 是“堿性-螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈”轉(zhuǎn)錄因子家族一員，定位于人染色體19q13.12，能以二聚體形式結(jié)合啟動子中含有E-box DNA 序列的靶基因，進而調(diào)控靶基因表達。既往研究多報道USF2 與腎病的關(guān)系，如USF2 能通過下調(diào)血小板反應(yīng)蛋白1，抑制轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）/Smad 家庭成員3 信號通路改善急性腎損傷［17］。目前關(guān)于USF2 與癌癥的研究報道較少，TGF-β 誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌中，USF2 表達上調(diào)能通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進癌細胞遷移和侵襲［18］，但關(guān)于USF2 參與結(jié)直腸癌進展的具體機制尚不明。研究表明，USF2 能通過調(diào)節(jié)Smad 泛素調(diào)節(jié)因子1（Smurf1）和Smurf2，調(diào)節(jié)UPP［19］。而UPP 是胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵途徑之一［15-16］。因此推測USF2 可能在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中USF2 mRNA 表達升高，與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示USF2 在胃癌中發(fā)揮促癌基因作用，其機制可能與USF2 能調(diào)節(jié)UPP 有關(guān)，但還需進一步明確其機制。本研究結(jié)果顯示，USF2 mRNA 高表達患者術(shù)后5 年累積生存率降低，是胃癌患者預(yù)后的獨立風(fēng)險因素，說明miR-875-5p或可成為胃癌患者預(yù)后評估指標。本研究結(jié)果還顯示，胃癌組織中miR-875-5p 與USF2 mRNA 表達呈負相關(guān)，生物學(xué)網(wǎng)站預(yù)測也發(fā)現(xiàn)USF2 可能是miR-875-5p 的靶基因，提示二者可能共同參與胃癌發(fā)生發(fā)展。周士誠等［20］通過雙熒光素酶基因也證實，miR-875-5p 在胃癌中靶向負反饋調(diào)控USF2 表達，抑制胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，進一步佐證了本研究結(jié)果。

綜上所述，胃癌組織中miR-875-5p 低表達，USF2 mRNA 高表達，二者與腫瘤分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)，可作為胃癌預(yù)后評估指標。但本研究樣本量較少，關(guān)于miR-875-5p、USF2參與胃癌的關(guān)系有待進一步研究。