張丹彤，逯素梅，馬萬山(山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院&山東省千佛山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，山東省醫(yī)藥衛(wèi)生臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250014)

中國肥胖者的比例正在逐年上升，誘發(fā)的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)也正在成為危害國人身體健康的重要慢性疾病。細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)家族是主要存在于肝臟、腸道中的單加氧酶，是自然界中發(fā)現(xiàn)的最大的以及功能最多樣的超家族之一，負(fù)責(zé)包括環(huán)境污染物、藥物、類固醇、脂肪酸等在內(nèi)的很多內(nèi)源性和外源性底物的代謝。CYP450在NAFLD及其相關(guān)疾病中的作用近年來被持續(xù)關(guān)注，值得進(jìn)一步深入總結(jié)和探討。

1 CYP450家族

CYP450有很多的亞型組成，人類約有57種CYP基因，被分成18個(gè)家族和43個(gè)亞家族。涉及藥物和脂肪酸代謝的CYP450主要為CYP1、CYP2、CPY3家族，負(fù)責(zé)大約75%的臨床藥物的代謝。肝臟是CYP基因表達(dá)的主要器官，其他器官如腦、小腸、腎臟、肺等也是CYP基因表達(dá)的來源[1]。

2 CYP450家族的檢測方法

據(jù)研究,患有NAFLD的個(gè)體對藥物性肝損傷的易感性更高，原因之一在于部分CYP450成員的活性受到抑制。因此,為盡量減輕肝臟損傷，在對患者用藥前可提前檢測NAFLD患者體內(nèi)CYP450活性，針對表達(dá)異常者推薦合適藥物劑量并密切關(guān)注肝功能水平。根據(jù)CYP450的特點(diǎn)，可以在DNA、RNA、蛋白質(zhì)以及酶活性等角度對其進(jìn)行檢測分析。CYP450最早的檢測方法為紫外分光光度法。隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步，CYP450檢測方法越來越多，也被逐漸應(yīng)用至科室檢測，除高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、發(fā)光法、ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量PCR對總CYP450以及各亞型檢測外，根據(jù)實(shí)際臨床檢測需求也開展了CYP450基因的多態(tài)性檢測。不同個(gè)體藥物治療效果不同，部分原因在于其體內(nèi)存在CYP450基因多態(tài)性。CYP450的基因多態(tài)性檢測對指導(dǎo)臨床用藥安全十分重要，例如CYP2C19*2和CYP2C19*3的多態(tài)性會引起基因編碼的酶活性喪失，會影響奧美拉唑、苯妥英鈉等藥物的代謝，在常規(guī)臨床劑量用藥時(shí)會引起患者體內(nèi)藥物的蓄積，使得藥物副作用增強(qiáng)。CYP2C19*17則使底物代謝能力增強(qiáng)，因此需增加用藥量?，F(xiàn)常用的多態(tài)性檢測方法主要有Sanger測序法、PCR-熒光探針法、CYP450檢測芯片。Sanger測序法被認(rèn)為是基因檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。經(jīng)過此方法驗(yàn)證出的CYP多態(tài)性序列，可以作為室間質(zhì)控品幫助實(shí)驗(yàn)室提高檢測質(zhì)量。但在實(shí)際室間質(zhì)控中使用Sanger測序進(jìn)行臨床標(biāo)本分析的實(shí)驗(yàn)室卻未能做到100%的準(zhǔn)確度，這可能與實(shí)驗(yàn)人員操作不規(guī)范、結(jié)果判讀發(fā)生錯(cuò)誤有關(guān)。PCR-熒光探針法卻在室間質(zhì)控中表現(xiàn)出100%的特異性與敏感性，室間質(zhì)控結(jié)果顯示出與測序驗(yàn)證的CYP450基因的野生型、純合以及雜合突變型結(jié)果一致，該方法在臨床檢測中能達(dá)到比Sanger測序更高的準(zhǔn)確度的原因或許在于此方法與Sanger測序相比操作較便捷，結(jié)果判讀較簡單[2-3]。美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)審批通過的可以用于臨床診斷的羅氏Amplichip CYP450微陣列包含超過15 000個(gè)核苷酸探針，共可分析31個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)。檢測首先對預(yù)先選定的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將片段標(biāo)記的DNA用于微陣列進(jìn)行雜交以及染色，激光掃描熒光雜交強(qiáng)度模式，軟件分析基因型和表型，此方法可一次性對多種SNP進(jìn)行檢測，較為便捷[4]。以上檢測方法的差異見表1。

表1 CYP450檢測方法學(xué)的比較

3 CYP450與肥胖、NAFLD關(guān)系的研究進(jìn)展

在肥胖患者的體內(nèi)可以觀察到CYP家族基因表達(dá)的變化。肥胖患者隨其體質(zhì)指數(shù)的增加，CYP3A發(fā)生降低，而CYP2E1水平發(fā)生升高[5-6]。兒童肥胖患者以及2型糖尿病患者的CYP1B1基因表達(dá)水平均顯著升高，并且多因素分析顯示CYP1B1對肥胖有很高的診斷潛力[7-8]。與健康人群相比， NAFLD患者中CYP450的表達(dá)也發(fā)生明顯改變，如表2所示，在NALFD的進(jìn)展期肝臟CYP2C19、CYP3A4的表達(dá)和活性隨著NALFD的進(jìn)展而降低[9]。但在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中，部分CYP450的活性變化不是一成不變的；例如僅在肝臟中存在的CYP1A2，其活性在NAFLD中呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，但由于觀察時(shí)間的原因，升高的過程常被忽略。由此可見CYP450家族的檢測或許可以成為一種篩查肥胖與NAFLD的潛在臨床指標(biāo)。

表2 肥胖及非酒精性脂肪性肝病患者P450表達(dá)變化

3.1CYP1家族 CYP1家族包括CYP1A和CYP1B兩個(gè)亞家族。CYP1A1是CYP1A亞家族的功能性基因。CYP1B1也被證明在調(diào)節(jié)脂肪酸、類固醇激素的代謝有重要作用。

3.1.1CYP1A1 NAFLD的形成及進(jìn)展與氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)，阻斷CYP1A1可以通過抑制活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平以及升高抗氧化劑超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平來抑制肝臟的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，致使丙二醛(malondialdehyde，MDA)、4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，HNE)的沉積減少；MDA有促進(jìn)載脂蛋白B100降解、降低低密度脂蛋白膽固醇分泌的功能，會導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)輸出減少，肝臟脂肪堆積加劇。MDA也是一種重要的炎癥介質(zhì)，可以誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的聚集和浸潤，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致肝進(jìn)一步損傷[10]。因此，對CYP1A1進(jìn)行干擾會在一定程度改善肝臟脂肪的堆積以及肝臟炎癥反應(yīng)。

此外，CYP1A1還是一種雌激素代謝酶。絕經(jīng)前女性免受肥胖相關(guān)的肝臟代謝并發(fā)癥的影響，這種保護(hù)機(jī)制與雌激素限制肝臟脂肪積累的能力有關(guān)。文獻(xiàn)表明，雌激素對肝臟脂肪變的發(fā)展具有明顯的保護(hù)作用，雌激素缺乏是導(dǎo)致肥胖以及NAFLD的主要原因之一[11]，CYP1A1活性的增高會導(dǎo)致雌激素缺乏。苯并芘(benzoapyrene，Bap)暴露會大大增加NAFLD的患病風(fēng)險(xiǎn)[12]，其機(jī)制之一在于BaP激活芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)通路后激活了CYP1A1的基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致雌激素代謝酶CYP1A1的過表達(dá)，使雌激素出現(xiàn)缺乏，抑制雌激素對肝臟的保護(hù)作用，導(dǎo)致肝臟中脂肪的積累增多[11]；α-萘黃酮是一種有效的AHR的抑制劑，其發(fā)揮作用的部分機(jī)制是通過抑制AHR-CYP1A1通路達(dá)到緩解NAFLD的目的[13]。

3.1.2CYP1B1 CYP1B1活性改變使很多肝臟基因的表達(dá)受到影響，其中包括與肝臟脂肪合成與轉(zhuǎn)運(yùn)堆積密切相關(guān)的多種因子[8]。干擾CYP1B1可以減輕肥胖、改善葡萄糖耐量和胰島素敏感性、改善肝臟中的脂代謝、抑制肝臟的增大[14]，其緩解NAFLD的作用機(jī)制部分在于CYP1B1干擾使得硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(stearyl coenzyme A dehydrogenase-1，SCD-1)、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶1(diacylglycerol acyltransferase，DGAT1)表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A(recombinant carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT-1a)以及腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)的表達(dá)上調(diào)。這些因子在體內(nèi)脂肪酸代謝中發(fā)揮重要作用。SCD-1是控制肝臟新生脂肪生成的末端酶。FAS催化生成長鏈脂肪酸，其活性的增加會導(dǎo)致游離脂肪酸的增加，長期使用FAS抑制劑可降低脂肪生成以及NAFLD的形成[15-16]。CD36分子參與肝臟脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，CD36的抑制會降低肝臟對脂肪酸的吸收[17]。AMPK在全身能量平衡中發(fā)揮重要作用，AMPK激活會增加脂肪酸的氧化，降低mTOR的磷酸化水平，增強(qiáng)肝臟自噬，抑制脂肪酸的合成，減輕肝臟脂肪變性[18]。另外，CYP1B1特異性抑制劑還可用于治療由于脂代謝紊亂致使的高膽固醇血癥引起的動脈粥樣硬化、高血壓，以及由于CYP1B1過表達(dá)引起的機(jī)體對部分抗癌藥物的耐藥性[19]。CYP1B1抑制劑的發(fā)現(xiàn)和使用可以為預(yù)防或者治療肥胖、脂肪肝提供新途徑。目前有50多個(gè)天然或合成化合物為CYP1B1的抑制劑，包含反式二苯乙烯、香豆素、生物堿、蒽醌和其他幾種化合物，其中二苯乙烯類的化合物是CYP1B1的高效特異性抑制劑。

3.2CYP2家族 CYP2家族是P450系統(tǒng)中最大的家族，CYP2家族有5個(gè)亞家族，其中研究比較多的亞型是CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1。其家族成員在類固醇激素、前列腺素和脂肪酸的代謝過程中發(fā)揮著重要作用。

CYP2E1在所有哺乳動物的肝組織以及肝外組織中均有表達(dá)，參與脂肪酸、甘油、臨床藥物、有毒化學(xué)品的生物轉(zhuǎn)化。CYP2E1的活性在肥胖、NAFLD患者中均顯著增加。CYP2E1活性的異常上調(diào)使胰島素受體底物1和2的磷酸化水平降低，胰島素信號敏感性減弱，促進(jìn)胰島素抵抗(insulin resistance,IR)的發(fā)生，IR又會促進(jìn)肝臟的脂質(zhì)堆積，另外IR導(dǎo)致患者體內(nèi)酮體增多，酮體會維持CYP2E1的穩(wěn)定，最后使得CYP2E1的降解減少，在體內(nèi)活性增加，進(jìn)一步加劇IR，形成惡性循環(huán)，而在NAFLD發(fā)生發(fā)展的第一擊中發(fā)揮作用[20]。此外，CYP2E1還具有較高的氧化酶活性，是體內(nèi)重要的氧化自由基的誘導(dǎo)劑，其表達(dá)的增加會使ROS的產(chǎn)生增多，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，在NAFLD形成發(fā)展的“第二擊”中發(fā)揮作用。ROS引起肝星狀細(xì)胞以及kupffer細(xì)胞的激活，引起細(xì)胞炎性因子的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)發(fā)生過氧化。生成的過氧化脂質(zhì)破壞肝臟細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，致使細(xì)胞功能失調(diào)、肝臟損害，同時(shí)也會通過活化IκB激酶β途徑引起NAFLD的發(fā)生[21]。此外，由ROS引起的鐵死亡，會進(jìn)一步加劇肝臟免疫細(xì)胞和炎癥浸潤[22]，促使非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)的發(fā)生。

黃酮類化合物具有保肝作用，并可通過調(diào)節(jié)CYP2E1的活性對NAFLD起到有益的作用。此外，CYP2E1的表達(dá)抑制在臨床中介導(dǎo)改善NASH肝臟炎癥的有效治療方法nanoSOD的肝保護(hù)作用中發(fā)揮部分作用[23]。總之，CYP2E1已被證明是NAFLD發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)十分關(guān)鍵的因素，有望成為一個(gè)重要的早期治療靶點(diǎn)。

3.3CYP3家族 CYP3家族只包含CYP3A一個(gè)亞家族。CYP3A在肝臟CYPs中含量豐富，約占30%，參與大約30%的臨床藥物代謝。

研究發(fā)現(xiàn)肝臟CYP3A的缺失會導(dǎo)致或加重脂肪肝。在NAFLD患者中CYP3A表達(dá)抑制與孕烷X受體(pregnane X receptor, PXR)有關(guān)。PXR是包括CYP3A在內(nèi)的多種CYPs的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。據(jù)報(bào)道，在患有NAFLD人體內(nèi)一種主要由肝臟分泌的激素成纖維細(xì)胞生長因子21表達(dá)升高，導(dǎo)致肝臟受體絲裂原活化蛋白激酶信號的激活，進(jìn)一步影響PXR或輔助伴侶蛋白的磷酸化，使PXR的激活抑制，PXR在核內(nèi)的移位減少，從而減少CYP3A基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[24]。另外一種機(jī)制是在NASH患者體內(nèi)常有的炎性浸潤會導(dǎo)致NF-κB被激活，活化的NF-κB會促使IL-6、TNF-α等炎癥因子的大量產(chǎn)生，同時(shí)炎癥浸潤會進(jìn)一步激活NF-κB，致PXR受到抑制，使CYP3A表達(dá)減少[25]，進(jìn)一步促使NAFLD的發(fā)展。

4 結(jié)語與展望

NAFLD是全球公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的慢性肝病，沒有藥物可以根治，臨床對于大多數(shù)患者的建議是通過減肥對脂肪肝進(jìn)行控制。但實(shí)際只有一小部分的患者可以減肥成功而達(dá)到控制脂肪肝的目的。因此，尋找安全有效的方法治療脂肪肝意義重大。CYP450家族與NAFLD的發(fā)生與發(fā)展密不可分，可為臨床治療提供新思路。并且在NAFLD發(fā)病率逐年增高且有年輕化趨勢的環(huán)境下，或許可以首先通過檢測CYP450水平對人群進(jìn)行初步篩查。