王娟娟，施旭東，吳梅香，陳凱(.南京中醫(yī)藥大學附屬南京醫(yī)院 南京市第二醫(yī)院檢驗科，南京 0003；. 東南大學附屬中大醫(yī)院重癥醫(yī)學科，南京 0009)

我國屬于30個高結核病負擔國家之一，2019年新發(fā)結核病例83.3萬人，結核病發(fā)病率為58/10萬[1]。傳統的病原學檢測主要是抗酸染色涂片和分枝桿菌培養(yǎng)。隨著分子生物學檢測技術的發(fā)展，2017年重新修訂的肺結核診斷標準中，已將分子生物學診斷陽性作為病原學陽性診斷依據[2]，其中Xpert MTB/RIF因高敏感性、特異性和簡單快速等優(yōu)點逐漸受到關注。本文對293例患者進行回顧性分析，探討不同分子生物檢測方法在肺結核診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選取2019年1月至2020年12月南京市第二醫(yī)院收治的住院患者293例，其中男192例，女101例，年齡(48±12.3)歲，依照《肺結核診斷標準WS 288—2017》[2]，結合患者臨床表現、影像學檢查、實驗室檢查等，最終臨床診斷為肺結核患者171例，非結核肺病患者122例。非結核肺病包括肺癌、非結核分枝桿菌肺病、隱球菌肺病、肺炎性假瘤、肺放線菌病等。所有患者均采集痰液標本送檢。本研究經南京市第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，患者及家屬知情同意。

1.2儀器與試劑 MGIT培養(yǎng)管、BACTEC MGIT營養(yǎng)添加劑及雜菌抑制劑(美國BD公司)，抗酸染色液、中性羅氏培養(yǎng)基、對硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基、噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基(珠海貝索公司)，結核分枝桿菌DNA熒光定量PCR(FQ-PCR)試劑盒(中山達安基因公司)，結核分枝桿菌RNA恒溫擴增檢測(SAT-TB)試劑盒(上海仁度生物科技公司)，GeneXpert MTB/RIF試劑盒(美國賽沛公司)；BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)檢測儀(美國BD公司)，ABI 7500型熒光定量PCR儀(賽默飛世爾科技公司)，GeneXpert檢測儀(美國賽沛公司)。

1.3方法

1.3.1抗酸染色涂片法 采用萋-尼氏抗酸染色法。操作參照試劑盒說明書和《痰涂片鏡檢質量保證手冊》。

1.3.2分枝桿菌快速培養(yǎng) 痰液標本使用N-乙酰-L-半胱氨酸氫氧化鈉(NALC-NaOH)去污處理，用pH6.8的磷酸緩沖液洗滌后，吸取0.5 mL加入含營養(yǎng)添加劑和雜菌抑制劑的MGIT培養(yǎng)管中，置于BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)檢測儀中檢測。根據《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》，陽性標本經抗酸染色涂片法確認后，用PNB、TCH鑒別培養(yǎng)基進行分枝桿菌菌種初步鑒定。如果2種鑒別培養(yǎng)基上均無分枝桿菌生長，報告為牛結核分枝桿菌；如果2種鑒別培養(yǎng)基上均有分枝桿菌生長，報告為非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacterium, NTM)菌群；如果PNB培養(yǎng)基上無分枝桿菌生長而TCH培養(yǎng)基上有分枝桿菌生長，報告為結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)。

1.3.3TB-DNA(FQ-PCR)檢測 按照試劑盒說明書對標本進行處理，后于熒光定量PCR儀中進行擴增檢測。

1.3.4SAT-TB檢測 按照試劑盒說明書對標本進行前處理，在核酸提取過程中，經超聲破碎裂解釋放出RNA，后于熒光定量PCR儀中擴增檢測。

1.3.5Xpert MTB/RIF檢測 處理液與痰液標本進行1∶2比例混合后，放置在渦旋振蕩器上渦旋0.5 min，溫育15 min后震蕩0.5 min，并再次溫育5 min直至標本液化完全。將混合液加入檢測匣，放置于GeneXpert檢測儀中檢測。

1.4統計學分析 用SPSS 22.0統計軟件進行。一致性分析采用Kappa檢驗，Kappa<0.4表示一致性較差，0.4≤Kappa<0.75表示一致性較好。計數資料以例數(n)或百分率(%)表示，不同方法陽性率比較采用配對χ2檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同檢測方法對肺結核的診斷效能 171例肺結核患者中有70例培養(yǎng)陽性，經初步鑒定均為MTB；122例非結核肺病患者中痰涂片陽性13例，經菌種鑒定，共獲得3種不同菌株，包括胞內分枝桿菌10例，鳥分枝桿菌2例，龜分枝桿菌龜亞種1例。以臨床診斷為金標準，分枝桿菌快速培養(yǎng)、TB-DNA(FQ-PCR)、SAT-TB和Xpert MTB/RIF在肺結核診斷中的特異性和陽性預測值均達100%，其中Xpert MTB/RIF和臨床診斷的一致性最高(Kappa=0.451)。見表1。

表1 不同檢測方法的診斷效能

2.2不同檢測方法和Xpert MTB/RIF的陽性率比較 293例患者中，Xpert MTB/RIF陽性85例，陽性率29.01%；痰涂片陽性70例，陽性率23.89%；快速培養(yǎng)陽性70例，陽性率23.89%；SAT-TB陽性56例，陽性率19.11%；FQ-PCR陽性75例，陽性率25.60%。FQ-PCR與Xpert MTB/RIF陽性率差異無統計學意義(χ2=2.89，P=0.087)。見表2。

表2 不同方法和Xpert MTB/RIF檢測結果比較

2.3不同分子檢測方法在肺結核中的陽性率 171例肺結核患者中，痰涂片陰性114例(66.67%)，培養(yǎng)陰性101例(59.06%)；涂片陽性培養(yǎng)陰性8例(4.68%)、涂片陽性培養(yǎng)陽性49例(28.65%)、涂片陰性培養(yǎng)陽性19例(11.11%)、涂片陰性培養(yǎng)陰性95例(55.56%)。不同分子生物學檢測方法的陽性檢出率見表3，其中Xpert MTB/RIF在4組患者中均有較高的陽性檢出率。

表3 不同分子檢測方法在肺結核中的陽性檢出率(%)

3 討論

本研究顯示，171例肺結核患者中涂片陰性占66.67%，培養(yǎng)陰性占59.06%，涂片、培養(yǎng)同時陰性占55.56%，提示在部分或未開展分子生物學檢測的醫(yī)療機構，當患者臨床表現不典型且缺乏明確的細菌學依據時，易造成誤診和漏診。

痰涂片法雖操作簡單、價格低廉，但其對標本含菌量要求高(103～104CFU/mL)[3]且無法區(qū)分MTB和NTM。本研究中非結核肺病患者中有13例痰涂片陽性，后經菌種鑒定均為NTM；分枝桿菌培養(yǎng)為傳統的金標準，特異性高，但其受培養(yǎng)時間長、僅活菌才可能生長等因素限制，不能為快速診斷提供依據。本研究中70例痰快速培養(yǎng)陽性菌株經鑒定均為MTB，分子生物學檢測無假陽性出現，特異性均達100%，部分報道[4]顯示存在假陽性，可能是合并NTM感染、標本試劑污染或結果判讀錯誤所致。

Xpert MTB/RIF針對rpoB基因81 bp利福平耐藥核心區(qū)間(RRDR)設計引物、探針，FQ-PCR使用的引物和探針位于349 bp的人型結核桿菌插入序列IS986。兩種方法檢測靶標均為DNA，部分患者經治療后體內仍有MTB核酸存在，因無法區(qū)分病原體活性，因此DNA檢測只能用于結核病的診斷和鑒別診斷，不能用于疾病進程監(jiān)測和療效評估。SAT-TB是以結核分枝桿菌特異的16S rRNA為檢測靶標，而RNA只存在于MTB活菌中且在環(huán)境中極易降解[5]，這可能是導致本研究中SAT-TB的敏感性(32.75%)和陽性率(19.11%)均較低的原因，提示臨床工作中標本采集后應及時送檢，防止因時間過久而出現假陰性。黃芳等[6]研究結果中Xpert MTB/RIF的敏感性(87.6%)明顯高于本研究(49.71%)，可能是因為研究對象不同所致，黃芳等研究納入對象均為確診肺結核患者且以分枝桿菌培養(yǎng)為金標準，另外Xpert MTB/RIF的最低檢測限為131 CFU/mL[3]，當痰液中菌量極低情況時不易檢出。

本研究中，FQ-PCR與Xpert MTB/RIF的總陽性檢出率雖相近，但Xpert MTB/RIF和臨床診斷的一致性最高，對培養(yǎng)陰性和涂片陰性的肺結核患者也有較高的檢出率。Xpert MTB/RIF是新型的分子生物學檢測方法且逐漸被證實具有較高的肺結核診斷效能，相對于傳統熒光定量PCR技術，在準確性、安全性和時效性方面更具優(yōu)勢。其以5條探針對檢測區(qū)域進行全覆蓋，內參設計確保結果更加準確可靠，獨立并自成體系的一次性反應盒避免了操作過程污染及環(huán)境因素對實驗結果干擾，最大程度減少實驗中氣溶膠的產生，整個過程可在2 h內完成[7]。肺結核患者臨床表現個體差異大，Xpert MTB/RIF更準確高效快速的優(yōu)勢可以實現對肺結核的早期診斷，更適合推廣使用。