于得全，邵秋菊，劉銳，梁軍，高宏，屈煥敏

空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院1放療科，3政治部，西安 710038

2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院放療科，西安 710038

軟組織肉瘤是一類來源于間充質(zhì)的異質(zhì)性腫瘤，約占成年人惡性腫瘤的1%[1]。軟組織肉瘤通常表現(xiàn)為無癥狀腫塊，多分布于腹膜后、內(nèi)臟和四肢。根據(jù)組織病理學(xué)的異質(zhì)性特征、臨床表現(xiàn)和分子特征，可將軟組織肉瘤分為50種不同的組織學(xué)類型[2]。軟組織肉瘤的治療方法主要是手術(shù)聯(lián)合放化療，但由于軟組織肉瘤亞型眾多，化療藥物的治療有效性很低，并且某些亞型對化療藥物的反應(yīng)有限，因此軟組織肉瘤患者的治療效果不是很滿意[3]。因此，尋找有價值的生物靶標尤為重要。甲狀腺激素受體相互作用蛋白13（thyroid hormone receptor interactor 13，TRIP13）位于人類5號染色體，能夠編碼包含432個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，是抗激動蛋白抗體（anti-actin antibody，AAA）-腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）家族成員之一。TRIP13主要參與紡錘體組裝檢查點（spindle assembly checkpoint，SAC）失活、染色體聯(lián)會和DNA斷裂或修復(fù)[4]。有研究表明，TRIP13在多種腫瘤中呈高表達，且與患者的不良預(yù)后有關(guān)[5]。然而，TRIP13在軟組織肉瘤中的表達和作用還缺乏研究。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析TRIP13在軟組織肉瘤中的表達、與預(yù)后的關(guān)系、突變情況及生物學(xué)功能，旨在為進一步分析軟組織肉瘤發(fā)生的分子機制和靶向治療提供基礎(chǔ)理論。

1 資料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫

Oncomine數(shù)據(jù)庫是一個公開訪問的在線數(shù)據(jù)庫，提供了多種腫瘤微陣列信息的全基因組轉(zhuǎn)錄分析[6]。本研究通過Oncomine數(shù)據(jù)庫分析TRIP13在常見腫瘤和軟組織肉瘤組織中的表達情況，檢索條件如下。①gene：TRIP13；②analysis type：cancer vs normal analysis；③cancer type：sarcoma；④data style：mRNA；⑤閾值條件：P-Value﹤0.05，F(xiàn)old Change﹤2，GENE Rank：Top 10%。

1.2 GEPIA數(shù)據(jù)庫

GEPIA數(shù)據(jù)庫是一個用于分析來自TCGA和GTEx的9376個腫瘤樣本和8589個正常樣本的RNA測序表達數(shù)據(jù)的平臺[7]。本研究通過GEPIA數(shù)據(jù)庫檢索TRIP13在軟組織肉瘤組織和正常組織中的表達量。

1.3 CCLE數(shù)據(jù)庫

CCLE數(shù)據(jù)庫是能夠為研究遺傳體變異、候選靶標、小分子和生物療法提供可靠數(shù)據(jù)的在線網(wǎng)站[8]。本研究通過CCLE數(shù)據(jù)庫檢索TRIP13在軟組織肉瘤細胞中的表達水平。

1.4 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫是基于TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中的癌癥數(shù)據(jù)分析基因表達與患者預(yù)后關(guān)系的開放性網(wǎng)站[9]。在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中每個分析的風(fēng)險比（hazard rate，HR）、95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）和P值均由網(wǎng)站自動生成，根據(jù)此參數(shù)患者被分為TRIP13高表達組和TRIP13低表達組，分析TRIP13表達水平對軟組織肉瘤患者總生存時間（overall survival，OS）和無病生存時間（disease-free survival，DFS）的影響。P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 cBioPortal數(shù)據(jù)庫

cBioPortal是一個可以分析多維癌癥基因組學(xué)的在線工具[10]。選取軟組織肉瘤數(shù)據(jù)（來自TCGA，PanCaner Atlas），分析TRIP13基因突變情況及突變類型。此外，研究TRIP13基因突變與軟組織肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系。P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 String數(shù)據(jù)庫

String數(shù)據(jù)庫是通過整合所有公開的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，預(yù)測蛋白質(zhì)的潛在功能[11]。本研究通過String數(shù)據(jù)庫探索與TRIP13相互作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，在數(shù)據(jù)庫中輸入“TRIP13”，物種選擇“Homo sapiens”，置信度設(shè)置為0.400，相互作用最大數(shù)設(shè)置為10。

1.7 Metascape數(shù)據(jù)庫

Metascape是一個基于40多個獨立的知識庫提供基因注釋、富集分析的網(wǎng)站[12]。將TRIP13共表達基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫，進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，參數(shù)設(shè)置如下?！癕in Overlap”：3；“P Value Cutoff”：0.01；“Min Enrichment”：1.5。

2 結(jié)果

2.1 TRIP13在常見惡性腫瘤中的表達情況

應(yīng)用Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索TRIP13在各種腫瘤中的表達情況，結(jié)果顯示，共有354項研究結(jié)果，106項研究結(jié)果顯示腫瘤組織和正常組織中TRIP13表達情況比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中TRIP13高表達的研究95項，TRIP13低表達的研究11項，TRIP13在大部分腫瘤中表達水平升高。（圖1）

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中TRIP13在不同腫瘤中的表達情況

2.2 TRIP13在軟組織肉瘤中的表達情況

本研究應(yīng)用Oncomine數(shù)據(jù)庫共檢索出10個顯示TRIP13在軟組織肉瘤組織和正常組織中表達水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)據(jù)集，主要包括黏液纖維肉瘤、多形性脂肪肉瘤、去分化脂肪肉瘤、黏液樣/圓形細胞脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤等（表1）[13-14]。10個數(shù)據(jù)集的薈萃分析顯示，與正常組織相比，TRIP13在軟組織肉瘤中呈顯著高表達（P=1.20×10-4），中位表達數(shù)值為346.5。應(yīng)用GEPIA2數(shù)據(jù)庫進行驗證分析，結(jié)果顯示，與正常組織相比，TRIP13的表達水平在軟組織肉瘤組織中升高。基于CCLE數(shù)據(jù)庫的結(jié)果，在39種不同腫瘤的細胞系中，TRIP13的表達水平仍以升高為主，其中軟組織肉瘤細胞系中TRIP13的表達水平排第12位（圖2）。TRIP13在軟組織肉瘤組織和細胞中表達水平均升高。

表1 TRIP13在不同類型軟組織肉瘤中的表達

圖2 CCLE數(shù)據(jù)庫中TRIP13在不同腫瘤細胞系中的表達差異

2.3 TRIP13表達與軟組織肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系

應(yīng)用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫對軟組織肉瘤患者進行生存分析。在259例患者的OS數(shù)據(jù)中，TRIP13高表達組（n=139）患者的中位OS為60.83個月，短于TRIP13低表達組（n=120）患者的82.13個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（HR=1.58，P=0.028）（圖3A）。在152例患者的DFS數(shù)據(jù)中，TRIP13高表達組（n=115）患者的DFS上四分位數(shù)為11.00個月，短于TRIP13低表達組（n=37）患者的49.33個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（HR=2.31，P=0.013）（圖3B）。

圖3 Kaplan-MeierPlotter數(shù)據(jù)庫分析TRIP13對軟組織肉瘤患者OS和DFS的影響

2.4 TRIP13突變情況及與軟組織肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系

應(yīng)用cBioPortal數(shù)據(jù)庫探索TRIP13在軟組織肉瘤患者中的突變情況，結(jié)果顯示，51例（21%）患者發(fā)生TRIP13基因突變，包括擴增、缺失和mRNA升高，其中mRNA升高的比例最高（圖4A、4B）。TRIP13突變組（n=51）患者的中位OS明顯短于TRIP13未突變組（n=200）（P=8.158×10-5），TRIP13突變組患者的中位DFS明顯短于TRIP13未突變組（P=4.4×10-6）（圖4C、4D）。

圖4 cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析軟組織肉瘤患者中TRIP13突變情況及與預(yù)后的關(guān)系

2.5 TRIP13的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

應(yīng)用String網(wǎng)站繪制TRIP13的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，共有11個節(jié)點，45條邊，與TRIP13相互作用的蛋白包括：DNA修復(fù)蛋白RAD51，減數(shù)分裂重組蛋白SPO11，BUB1有絲分裂檢查點絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（BUB1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase B，BUB1B），極光激酶B（aurora kinase B，AURKB），細胞分裂周期5樣蛋白（cell division cycle 5 like，CDC5L），細胞分裂周期蛋白 20（cell division cycle 20，CDC20），驅(qū)動蛋白家族成員11（kinesin family member 11，KIF11），細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1），細胞周期蛋白A2（cyclin A2，CCNA2），有絲分裂阻滯缺陷 2樣蛋白 1（mitotic arrest deficient 2 like 1，MAD2L1）。（圖5）

圖5 String數(shù)據(jù)庫中繪制TRIP13的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.6 TRIP13相關(guān)的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

為進一步探究TRIP13在軟組織肉瘤中的潛在分子機制，應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫對與TRIP13相互作用最密切的蛋白進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析結(jié)果顯示，生物學(xué)過程（biological process，BP）包括細胞周期檢查點、細胞分裂、蛋白質(zhì)定位到染色體、組蛋白磷酸化、減數(shù)分裂、DNA修復(fù)，細胞成分（cell component，CC）主要包括紡錘體、染色體區(qū)、細胞質(zhì)核周區(qū)、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體，分子功能（molecular function，MF）主要包括激酶活性、ATP酶活性、蛋白激酶活性。KEGG通路主要包括細胞周期、人T細胞白血病病毒1感染、黃體酮介導(dǎo)的卵母細胞成熟、卵母細胞減數(shù)分裂、病毒致癌作用。（圖6）

圖6 Metascape數(shù)據(jù)庫中GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

3 討論

軟組織肉瘤的組織類型較多且具有異質(zhì)性，目前缺乏有效的診斷和治療手段，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一些與軟組織肉瘤相關(guān)的分子如鋅指蛋白1并列體（juxtaposed with another zinc finger protein 1，JAZF1）、多梳蛋白 SUZ12、14-3-3蛋白質(zhì)ε（14-3-3 protein epsilon，YWHAE）、NUT家族成員2（NUT family member 2，NUTM2）、碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydraseⅨ，CAⅨ）相繼被發(fā)現(xiàn)[15-16]。通過研究這些分子與軟組織肉瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，進一步尋找生物靶標，能夠?qū)浗M織肉瘤的診斷和治療提供幫助，有利于改善患者的預(yù)后。

TRIP13通過調(diào)節(jié)SAC的活性維持染色體基因組的穩(wěn)定性，在有絲分裂染色體的分離中具有至關(guān)重要的作用[17]。而染色體的不穩(wěn)定性可以使細胞具有更多種類的體細胞拷貝數(shù)改變（somatic copy number alteration，SCNA），促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。研究發(fā)現(xiàn)，TRIP13的表達水平與多種腫瘤密切相關(guān)。Zhang等[19]研究表明，TRIP13能夠與YWHAZ相互作用，通過調(diào)節(jié)G2/M期轉(zhuǎn)化和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促進結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移。另一研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA）-515-5p可能通過靶向TRIP13抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲[20]。

然而，目前關(guān)于TRIP13在軟組織肉瘤中表達情況的研究較少。本研究首先通過Oncomine數(shù)據(jù)庫獲得TRIP13在多種腫瘤中的表達數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，TRIP13在多種腫瘤中扮演癌基因的角色，尤其是在軟組織肉瘤中，有10個具有統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)據(jù)集。GEPIA和CCLE數(shù)據(jù)庫驗證了這一觀點。然后應(yīng)用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析了TRIP13表達水平與軟組織肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明，TRIP13高表達的患者具有較短的OS和DFS，與TRIP13是癌基因的觀點一致。由于基因組學(xué)的改變是軟組織肉瘤的特征，本研究又通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫探討了TRIP13突變對軟組織肉瘤患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示，TRIP13在軟組織肉瘤患者中的突變率為21%，其中mRNA升高的比例最高，并且TRIP13突變患者的預(yù)后更差，提示TRIP13可能是判斷軟組織肉瘤預(yù)后的新靶標。為了進一步研究軟組織肉瘤的發(fā)病機制，本研究應(yīng)用String和Metescape數(shù)據(jù)庫分析TRIP13的共表達基因以及功能富集和通路富集。與TRIP13關(guān)系最密切的是RAD51，RAD51是一種腺苷三磷酸酶，可在單鏈DNA上形成核蛋白絲。RAD51通過調(diào)節(jié)DNA雙鏈斷裂修復(fù)、復(fù)制應(yīng)激和減數(shù)分裂維持DNA復(fù)制的保真度[21]。準確的DNA修復(fù)和復(fù)制對于基因組穩(wěn)定性和腫瘤預(yù)防至關(guān)重要。有研究證實，在長期暴露于鉻顆粒的肺癌細胞中，RAD51發(fā)生同源重組，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，染色體不穩(wěn)定，促進肺癌的發(fā)生[22]。說明TRIP13可能主要通過影響腫瘤細胞的減數(shù)分裂過程，改變細胞的增殖、分化和凋亡過程。

本研究也具有一定的局限性，首先，本研究通過生物信息學(xué)方法分析了TRIP13在軟組織肉瘤中的表達水平及與預(yù)后的關(guān)系，但由于應(yīng)用來自多個不同數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，很難保證不同數(shù)據(jù)庫之間的統(tǒng)一性。其次，由于數(shù)據(jù)庫中缺少軟組織肉瘤臨床分期和病理類型數(shù)據(jù)，未研究TRIP13在不同臨床分期和病理類型軟組織肉瘤中的作用，這需要收集標本進一步研究證實。最后，沒有利用基礎(chǔ)實驗驗證這些數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，這將在未來的研究中完成。后續(xù)可以繼續(xù)驗證TRIP13的表達與組織亞型、轉(zhuǎn)移、病理分級的關(guān)系，進行相應(yīng)的基礎(chǔ)實驗，探究軟組織肉瘤的發(fā)病機制。

綜上所述，TRIP13可能在軟組織肉瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，有望成為軟組織肉瘤診斷和治療的新靶標。