許文博，吳麗梅，劉 鑫，李 升，黃復深,2*，李潤成

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙 410128； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學，湖南獸藥工程技術研究中心，長沙 410128)

多殺性巴氏桿菌()是一種分布廣泛，能引起豬、羊、牛、雞、兔、馬、鵝、人等多個宿主致病的革蘭陰性菌。常在宿主營養(yǎng)不良和抵抗力下降時引起巴氏桿菌病，如禽霍亂、豬的萎縮性鼻炎和牛的呼吸道疾病等，對動物和人類健康造成極大的危害。根據(jù)莢膜抗原免疫原性的差異，多殺性巴氏桿菌可分為A、B、D、E和F 5個莢膜血清型，16個脂多糖血清型(Heddleston血清型，分成L1 ～ L16)。隨著分子生物學技術的發(fā)展，現(xiàn)已建立了多種分子分型方法，如多位點序列分型法(MLST)、基于脂多糖外核編碼基因簇的PCR分型法。

的致病性與莢膜等多種毒力因子有關。它們通過損傷宿主的有關組織和侵害宿主的防御系統(tǒng)并激發(fā)炎癥反應來促進該菌的侵襲和定殖，從而引起疾病。的毒力因子多種多樣，包括莢膜、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、菌毛、黏附素、毒素、鐵調(diào)節(jié)和鐵攝取蛋白、透明質(zhì)酸酶、參與唾液酸代謝的酶、多種外面蛋白等。不同血清型的有一定的宿主偏好性，毒力因子的分布在不同血清型以及同一血清型的不同菌株之間存在多態(tài)性。研究不同菌株的毒力因子特點，對于了解的致病機制以及巴氏桿菌病的防治具有重要的參考價值。

CS株是從發(fā)病豬的肺部病變組織分離到的一個強毒株，為探討該病原菌的致病機制，作者對其致病基因組進行了分析，研究結(jié)果將為更進一步了解CS株致病作用的分子機制積累資料。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離和分型鑒定

CS株由湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院李潤成博士從豬肺疫病患豬肺部病料中分離得到。分離株經(jīng)含有5%小牛血清的TSB 37 ℃培養(yǎng)過夜，收集菌液，按TIANamp Bacteria DNA Kit 細菌基因組DNA 提取試劑盒說明[天根生化科技(北京)有限公司]提取CS株基因組DNA，利用16S rRNA基因引物(F：5′-AGAGT-TTGATCCTGGCTCAG-3′；R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR鑒定，測序后，經(jīng)分析確定是否為。根據(jù)全基因組序列中有關DNA片段，確定CS株的莢膜血清型、MLST和Heddleston血清型分型。

1.2 P. multocida CS株的毒力鑒定和小鼠致病試驗

取4周齡重18～22 g SPF 昆明小鼠(購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)50只。隨機分為A、B、C、D和E 5組，每組10只。將細菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌液，調(diào)整成1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10CFU·mL多個濃度，分別按200 μL· 只對A、B、C、D 組小鼠進行滴鼻攻毒。對照組E接種等量的生理鹽水。攻毒12 h后，記錄小鼠發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察7 d。利用寇氏法計算半致死劑量(median lethal dose，LD)。

調(diào)整培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細菌至濃度為5×10CFU·mL，按200 μL·只滴鼻感染小鼠，觀察小鼠感染后的臨床表現(xiàn)和死亡情況。解剖小鼠，觀察肺部的眼觀病理學變化；取小鼠肺部病變組織，10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察小鼠肺部組織病理學變化。

1.3 全基因組測序及組裝

收集于含5%小牛血清的TSB中37 ℃過夜培養(yǎng)的細菌，按TIANamp Bacteria DNA Kit 細菌基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]說明提取CS株基因組DNA。用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)核酸濃度檢測儀檢測樣品DNA的純度和濃度。

細菌基因組測序和組裝由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。即：取檢測合格的基因組DNA構建基因組小片段文庫(350 bp)，利用Illumina2的HiSeq2500 測序平臺進行雙末端測序，測序深度200×。獲得的原始數(shù)據(jù)去除引物、接頭和篩除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)之后，利用短序列組裝軟件SOAPdenovo2 (http://soap.genomics.org.cn/) 對二代測序后的優(yōu)化序列拼接，得到最優(yōu)的contigs 組裝結(jié)果。contigs 之間的拼接組裝由PCR 擴增及測序的方式完成。

1.4 基因預測及功能注釋分析

使用Glimmer (http://ccb.jhu.edu/software/glimmer/index.shtml)預測細菌染色體基因組中的CDs，利用tRNAscan-SE v2.0 軟件(http://trna.ucsc.edu/software/)預測基因組中轉(zhuǎn)運RNA (tRNA)基因，利用Barrnap 軟件(https://github.com/ tseemann/barrnap)預測基因組中核糖體RNA(rRNA)基因。編碼序列的功能注釋通過與GO(gene ontology)、COG(clusters of orthologous groups)和KEGG(kyoto Encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫Blast比對完成。

1.5 致病基因組分析

毒力基因預測和病原菌宿主互作采用Diamond(https://github.com/ bbuchfink/diamond)和PHI(http://www.phi-base.org/)數(shù)據(jù)庫注釋比較分析軟件進行比對分析，毒力基因注釋使用致病菌毒力因子數(shù)據(jù)庫(The virulence factor database，VFDB)(http://www.mgc. ac.cn/VFs/)進行，分泌系統(tǒng)采用KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)進行注釋。分泌蛋白分析采用信號肽預測工具SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)進行。雙組分調(diào)控系統(tǒng)由hmmer3(http://www.hmmer.org/)預測，并篩選與分泌系統(tǒng)相關蛋白。

1.6 進化分析

查找GenBank數(shù)據(jù)庫，下載不同地域、不同宿主來源和不同血清型具有全基因組序列的67株，利用mafft進行單拷貝同源基因?qū)R，經(jīng)Gblocks進行非同源片段剪切后，使用RaAXML的最大釋然法(maximum likelihood，ML)構建進化樹。

2 結(jié) 果

2.1 P. multocida CS株對小鼠的致病性分析

將16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果，經(jīng)Blast分析，鑒定該菌為血清A型。毒力測定結(jié)果表明，小鼠感染后48 h，A和E組全部存活，且未見顯著臨床癥狀；B、C、D組小鼠逐漸顯現(xiàn)精神不振，食欲下降，被毛粗亂，閉目，嗜睡等癥狀；C組和D組小鼠全部死亡；B組感染后48 h 6只死亡，72 h后，又有3只死亡，余下的1只逐漸恢復進食，7 d后恢復正常。根據(jù)寇式法計算CS株對小鼠的LD為5×10CFU·mL。可見，該分離株毒力較強。

發(fā)病小鼠肺眼觀病變可見出血點、淤血和水腫現(xiàn)象。組織病理學可觀察到肺泡壁增生塌陷明顯，肺泡腔減小，有大量的炎性滲出和炎癥細胞(圖1)。

A.正常小鼠肺組織；B.感染小鼠肺組織。掃文章首頁OSID碼可查看彩圖A.Histological section of health mice; B. Histopathical section of infected mice. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page圖1 P. multocida CS株感染小鼠肺部的組織病理學觀察Fig.1 Histopathogical observation of lungs in mice infected with P. multocida CS strain

2.2 P. multocida CS株全基因組序列的遺傳結(jié)構

將測序后的CS株全基因組信息提交至NCBI，獲得登錄號 SUB11119617。通過對CS株的全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，該菌株全基因組大小為2 599 048 bp，G+C含量為39.932%，編碼2 580個 基因，其中tRNA53個，rRNA3個。其全基因組的遺傳結(jié)構如圖2。序列分析發(fā)現(xiàn)，該菌株為L6型。結(jié)合血清型鑒定結(jié)果，將其命名為CS株(type A: L6)。編碼基因的COG分類如圖3。

2.3 P. multocida CS株的系統(tǒng)進化分析

通過分析篩選到31個看家基因(、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、)，以此構建基于67株的系統(tǒng)進化樹(圖4)。從圖可見，67株可分為7個分支，其中，F(xiàn)血清型為獨立的1個分支，A、B和D血清型構成另外6個分支。CS株屬第Ⅶ分支，該分支包含1個豬源性、2個牛源性的血清A型毒株(CP001409.1、CP030096.1、CP033598.1)，和1個豬源性的D型毒株(CP003313.1)。同時作者也發(fā)現(xiàn)血清A、B和D型未形成獨立的分支。同時，從圖還可分析發(fā)現(xiàn)，寄生于禽類的主要為L1型，寄生于牛的主要為L3型，寄生于豬的主要為L3型和L6型?？梢?，相對L血清型分類系統(tǒng)，存在一定的宿主偏好性(圖4)。

2.4 P. multocida CS株的毒力基因分析

本研究從CS株全基因組共篩選到254個毒力基因，其中141個可利用VFDB的毒素分類體系進行歸類。這些基因共分為4大類(表1)，即：43個非特異性毒力因子(nonspecific virulence factor)編碼基因，其中，鐵攝取相關基因40個和胞外酶基因3個； 37個防御性毒力因子(defensive virulence factors)編碼基因，其中抗吞噬基因23個，細胞代謝基因2個，相突變(phase variation)基因3個和壓力蛋白基因9個；58個攻擊性毒力因子(offensive virulence factors)基因，其中黏附基因35個，分泌系統(tǒng)基因15個，侵入基因7個和肌動蛋白運動基因1個；毒力調(diào)節(jié)相關基因(regulation of virulence-associated genes)4個，這一類全部為調(diào)節(jié)基因。

掃文章首頁OSID碼可查看彩圖。圈圖從外到內(nèi)第1圈和第4圈為正鏈、負鏈上的CDS，不同的顏色表示不同的COG功能分類；第2圈和第3圈分別為正鏈、負鏈上的CDS、tRNA、rRNA；第五圈為GC含量，向外的部分表示該區(qū)域GC含量高于全基因組平均GC含量，向內(nèi)的部分表示該區(qū)域GC含量低于全基因組平均GC含量；第六圈為GC-Skew值，一般前導鏈GC skew>0，后滯鏈GC skew<0，也可以輔助判斷復制起點(累計偏移最小值)和終點(累計偏移最大值)，尤其對環(huán)狀基因組最為重要；最內(nèi)一圈為基因組大小標識The color picture can be found by scanning the OSID code on the front page. Circle 1-4 indicate CDs distrubition of positive and negative chain (colour indicates gene function classication) in scaffold sequence; Circle 2 and 3 indicate CDS, tRNA, rRNA gene distrubition of positive and negative chain in scaffold sequence; Circle 5 indicates GC content. Outside part indicates that GC content is higher than the average content and inside part indicates less than the average content; Circle 6, GC skew. G+C skew > 0 (yellow green) means this region is leadin g chain and G+C skew < 0 (purple) means this region is logging chain圖2 P. multocida CS株基因組圈圖Fig.2 Circular genome maps of P. multocida CS strain from outside to inside indicate the following

掃文章首頁OSID碼可查看彩圖The color picture can be found by scanning the OSID code on the front page圖3 P. multocida CS株核心基因的 COG 注釋結(jié)果Fig.3 COG annotation results of core gene set of P. multocida CS strain

圖4 P. multocida CS株的系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic relationship of P. multocida CS strain

通過對CS株與本研究引用的67個不同菌株的毒力基因比較發(fā)現(xiàn)，鐵攝取系統(tǒng)相關的多個基因在不同菌株間的出現(xiàn)頻率存在差異(表2)?；蛟谘錋型的總分布頻率為66.67%，但不同宿主檢出率差異較大，其中，羊和人檢出率為0%，禽檢出率為87.5%，豬檢出率為12.5%，牛檢出率為10%。就血清型而言，基因在牛血清B型分布頻率為50.00%， 牛血清D和F型的基因組均未檢測到，基因在血清A型分布頻率為86.67%，豬、牛和人檢測率為100%，禽為87.5%，豬血清D型為100%，山羊和人未檢測到，山羊和人血清B型與F型分布頻率都為0%。和基因在不同基因組的分布存在多態(tài)性。

表1 P. multocida CS株毒力基因分類

黏附相關的一些基因在不同宿主和不同血清來源的菌株出現(xiàn)的頻率存在差異(表2)。基因血清A型的分布頻率為66.67%，其中豬、狗和人的檢出率為100%，羊和嚙齒動物的檢出率為0%，禽的檢出率為12.5%，牛的檢出率為90%；在血清型B的分布頻率為50.00%；在血清型D和F型中分布頻率為0%?；蛟谘錋型的分布頻率為56.67%，其中豬和人的檢出率為100%，狗、嚙齒動物和羊的檢出率為0%，牛的檢出率為10%，禽的檢出率為87.5%；豬血清D型的檢出率為100%，羊和人的檢出率為0%；在血清B型和F型檢出率為0%?？梢姡蚝突蛟诓煌蚪M的分布存在多態(tài)性，是否與細菌的毒力相關有待進一步研究。

2.5 P. multocida CS株的分泌系統(tǒng)和其轉(zhuǎn)運蛋白分析

分泌系統(tǒng)與細菌的毒力密切相關。分析發(fā)現(xiàn)，血清型A的分泌系統(tǒng)包括Ⅰ型、Tat型、Sec-SRP型3種類型(表3)。其中Ⅰ型分泌系統(tǒng)由基因組成，Tat型包括、、3個 基因，Sec-SRP型分泌系統(tǒng)由11個基因組成，分別為、、、、、、、、、、。Sec分泌系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運蛋白包括SPⅠ和Ⅱ 2種。本研發(fā)現(xiàn)，CS株的Sec分泌系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運蛋白共153個，其中SPⅠ型149個(149/153)，4個未定型。經(jīng)TMHMM預測發(fā)現(xiàn)，這些SPⅠ 型分泌蛋白有26個為跨膜蛋白，19個蛋白含1個跨膜區(qū)，有2個含2個跨膜區(qū)，2個含3個跨膜區(qū)，1個有5個跨膜區(qū)，1個含8個跨膜區(qū)，10個跨膜區(qū)的有1個。

通過對不同血清型菌株分泌系統(tǒng)的基因分布頻率分析發(fā)現(xiàn)，基因在不同血清型的分布差異明顯，血清A型菌株分布頻率為60%，B型菌株分布頻率為50%，D型菌株分布頻率為66.67%，F(xiàn)型菌株分布頻率為0%。A型中不同宿主差異較大，其中禽、嚙齒動物和羊的檢出率為0%，狗和人的檢出率為100%，豬的檢出率為87.5%，牛的檢出率為90%。豬和人血清型D的檢出率都為100%，羊的檢出率為0%。

表2 P. multocida毒力基因在不同血清型分布的比較

表3 P. multocida CS株的分泌系統(tǒng)

2.6 P. multocida CS株的雙組分調(diào)控系統(tǒng)分析

雙組分調(diào)控系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，中存在30個雙組分調(diào)控相關基因，分為3種類型(表4)。其中調(diào)節(jié)子(regulator)相關基因有16個，包括、、、、、、、、、、、、、、和，感應子(sensor)相關基因有12個，分別為、、、、、、、、、、和，包括hybrid相關基因有2個，即和。

表4 不同血清型P. multocida菌株雙組分調(diào)控系統(tǒng)比較

3 討 論

多殺性巴氏桿菌是一種宿主非常廣泛的病原菌，可引起多種疾病。CS株分離于豬肺疫患豬病料中，經(jīng)鑒定為多殺性巴氏桿菌血清A型。通過對基因組相關序列分析，發(fā)現(xiàn)該菌屬于Heddleston血清型分類中的L6。小鼠毒性試驗顯示，該菌對小鼠的LD為5×10CFU·mL，顯示較強毒性。小鼠感染后，顯現(xiàn)精神不振、食欲下降、被毛粗亂、嗜睡等癥狀。眼觀病變可見，肺有出血點、淤血和水腫現(xiàn)象。組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)，致病小鼠肺泡壁增生塌陷明顯，肺泡腔減小，伴有大量炎性滲出和炎性細胞。

本研究報道了CS株全基因組信息(登錄號 SUB11119617)。通過對CS株的全基因組序列分析，結(jié)果表明CS株全基因組大小為2 599 048 bp， G+C含量為39.932%，編碼CDs 為2 580個，占整個基因組長度的69.6%，編碼基因的平均長度為952 bp。編碼基因中有87.95%可進行COGs功能分類，29個為未知功能基因。此外，還有53個tRNA基因和3個rRNA基因。CS株基因組的這些特征和以往報道的有關基因組的基本相同。

通過對利用ML法對來源于不同宿主和地域具全基因組序列的67個分離株構建基于31個全基因組單拷貝核心基因的系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，這些菌株可分為9個分支，其中所有血清型F為獨立的一個分支，血清A、B和D型形成另外8個分支，且這些分支沒有明顯地域偏好性。同時筆者也發(fā)現(xiàn)血清A、B和D型未形成獨立的分支。屬于第Ⅶ分支。該支中包含3個豬源性和2個牛源性血清A型毒株，以及1個來源于豬的D型毒株。對于Heddleston血清型而言，寄生于禽類的主要為L1型，寄生于牛的主要為L3型，寄生于豬的主要為L3型和L6型。顯示一定的宿主偏好性。不同菌株在不同宿主存在優(yōu)勢分布。這一結(jié)果與Peng等基于全基因組單拷貝核心基因的單核苷酸多態(tài)性聚類分析研究結(jié)果基本一致。

通過對進化樹的分析發(fā)現(xiàn)，第Ⅱ、Ⅷ支包括血清A型、血清B型和D型，相對于血清型F，它們有較近的近緣關系。這個結(jié)果是否說明血清A型、B型和D型為多元起源，有待進一步證明。進一步分析LPS血清型、Heddleston血清型和MLST的進化關系發(fā)現(xiàn)，血清F型皆為L3: ST9，其他LPS血清型未見ST9。ST9與血清F型是否有對應關系，有待進一步研究。同時還發(fā)現(xiàn)，第Ⅰ支主要為ST129，第Ⅲ和第Ⅳ支為ST79，第Ⅴ支為ST13，第Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ支則存在多態(tài)性，這幾支主要為血清A型，血清A型的進化與MLST分型的關系值得進一步分析。

毒力因子是衡量微生物毒性的重要指標，是引起宿主致病的重要因素。分析發(fā)現(xiàn)株含254個毒力相關基因，根據(jù)VFDB數(shù)據(jù)庫的分類方法包括4大類11小類。通過對這些基因在不同血清型和同一血清型的不同分離株的分析發(fā)現(xiàn)，鐵攝取系統(tǒng)、黏附系統(tǒng)和雙組分調(diào)控系統(tǒng)相關的多個基因在不同的毒株(包括血清型)的出現(xiàn)頻率存在多態(tài)性。鐵是細菌生長發(fā)育的必需營養(yǎng)物質(zhì)，鐵結(jié)合受體是細菌鐵攝入受體系統(tǒng)的重要組成部分，負責將鐵運送到細菌的細胞內(nèi)。細菌的鐵結(jié)合受體包括TbpA和TbpB。耶爾松菌的研究發(fā)現(xiàn)，TbpA是高度保守的蛋白，幾乎存在于所有的致病菌株中，是細菌致病的重要分子基礎。本研究在CS株的基因組只檢測到基因，未發(fā)現(xiàn)基因。這和以往有關牛的報道一致。本研究發(fā)現(xiàn)，可存在牛、禽、豬的基因組中，且出現(xiàn)頻率在不同的血清型有差異。Ewers等利用PCR和DNA雜交技術對289株不同宿主來源的進行檢測，發(fā)現(xiàn)只存在于反芻動物的基因組中。Farahani等利用PCR技術研究發(fā)現(xiàn)，在所檢測的63株禽和牛中，禽基因組的檢出率為23.3%，牛為100%。我國豬群的檢出率低于10%。本試驗采用的是GenBank記錄的具有全基因組序列的，二者的差異是否是因為PCR和DNA雜交技術的靈敏性所致，有待進一步證明。由于本研究采用的樣本主要來自血清A型，其他血清型的樣本數(shù)少，因此，在基因組中出現(xiàn)頻率的多態(tài)性是否能反映不同毒株毒力的差異，有待進一步研究。此外，還發(fā)現(xiàn)基因以及黏附的相關的基因和基因在強毒血清型(血清A型)的分布較高。這種群體遺傳學特征與前人的研究結(jié)果基本一致。這個結(jié)果是否推斷這可能是同一血清型的不同菌株毒力強弱差異的原因之一，有待進一步研究。

分泌系統(tǒng)與細菌的毒力息息相關。本研究發(fā)現(xiàn)，CS株的分泌系統(tǒng)由Ⅰ型(基因)、Tat型、Sec-SRP型3種類型組成。通過對不同血清型的的分泌系統(tǒng)基因組成的比較分析發(fā)現(xiàn)基因在A型菌株的分布頻率為60%，在B型菌株中的分布頻率為50%，在D型菌株中的分布頻率為66.67%，而F型菌株中分布頻率為0%?；虻姆植际欠癫煌甓玖Σ煌脑蛴写M一步研究。

雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)(TCSs)是原核生物中最主要的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，由感受蛋白和調(diào)節(jié)蛋白等組成。有些雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)本身就為毒素蛋白。雙組分調(diào)控系統(tǒng)使細菌能夠感知、響應和適應廣泛的環(huán)境、壓力源和生長條件，這些環(huán)境刺激在細菌致病菌侵染過程中可發(fā)揮調(diào)控作用。病原菌在侵染不同階段對微環(huán)境的適應不僅需要表達特定的毒力因子，還需要對代謝過程進行緊密的調(diào)控，在這些過程中，雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)都起到了重要作用。本研究中筆者共發(fā)現(xiàn)16個調(diào)節(jié)相關基因，12個 感應相關基因和2個hybrid相關基因。這些基因在不同血清型的分布存在多態(tài)性，這個現(xiàn)象與的毒力關系，有待進一步研究。

4 結(jié) 論

通過對從豬體內(nèi)分離的多殺性巴氏桿菌CS株的毒力分析發(fā)現(xiàn)，該分離株為血清型，具較強毒性，與 1個豬源性、2個牛源血清A型毒株和1個豬源性血清D型毒株有較近的親緣關系。全基因組分析發(fā)現(xiàn)，其基因組的基本特征與GenBank收錄的多殺性巴氏桿菌的基因組基本相同；基因組含254個毒力相關基因，其中鐵攝取系統(tǒng)、黏附系統(tǒng)、分泌系統(tǒng)和雙組分調(diào)控系統(tǒng)的基因在不同的血清以及同一血清型內(nèi)出現(xiàn)頻率存在多態(tài)性。該結(jié)果為進一步研究多殺性巴氏桿菌不同血清型的進化和致病機制等的研究積累了基礎資料。