焦鳳超　李迎曉　陳宏智　肖世文

摘要：對河南省信陽市送檢的疑似鴨疫里默氏桿菌感染病鴨進行病原菌的分離鑒定。根據(jù)培養(yǎng)特性和生化鑒定結(jié)果分離出6株鴨疫里默氏桿菌；經(jīng)平板凝集試驗確定出血清1型1株，血清2型2株，另外3株未定型；人工感染試驗表明，分離菌株對櫻桃谷肉雛鴨有很強的致病性。

關鍵詞：鴨疫里默氏桿菌；血清型；致病性

中圖分類號： S858.322.61文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0166-02

收稿日期：2013-05-17

基金項目：河南省科技攻關項目（編號：122102110022）。

作者簡介：焦鳳超（1979—），男，河南西平人，碩士，講師，從事病原微生物與免疫學研究。E-mail：fengchaojiao@163.com。鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer）引起鴨、鵝、火雞以及其他鳥類的一種接觸傳染病[1]，別稱鴨傳染性漿膜炎，主要侵害2～8周齡的雛鴨，呈急性或慢性敗血癥，其特征是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎，也可能發(fā)生無任何臨床癥狀的呼吸道感染，發(fā)病率5%～90%，死亡率高達90%[2]。由于該菌血清型眾多，各血清型間無交叉保護作用且存在地域差異，所以導致目前疫苗的免疫預防效果不是十分理想。本研究通過對河南省信陽市部分地區(qū)疑似鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定和血清型分析，以期為該地區(qū)鴨疫里默氏桿菌病的免疫預防提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料病料取自河南省信陽市送檢的10份鴨疫里默氏桿菌病疑似病例的腦、心血、肝、脾等組織。

1.1.2菌株及陽性血清鴨疫里默氏桿菌1、2型菌株和標準血清由華中農(nóng)業(yè)大學贈送。

1.1.3主要培養(yǎng)基麥康凱瓊脂、TSA、TSB等培養(yǎng)基購自浙江杭州天和微生物試劑有限公司；小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.4細菌微量生化管細菌微量生化管購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.5試驗動物試驗用健康櫻桃谷肉雛鴨購自河南華英集團公司。

1.2方法

1.2.1病原菌分離無菌采集病死鴨的腦、心血、肝臟等病料，劃線接種到TSA（含5%小牛血清）培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上，置于燭缸內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細菌的生長情況。在TSA培養(yǎng)基上生長而不能在麥康凱培養(yǎng)基上生長的菌落為可疑鴨疫里默氏桿菌，挑取單菌落在TSA（含5%小牛血清）培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)，待進一步鑒定[3]。

1.2.2病原菌染色鏡檢挑取TSA平板上單個可疑菌落，進行革蘭氏和瑞氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。

1.2.3生化試驗按程安春等的方法[4]采用微量發(fā)酵管（添加10%小牛血清）進行常規(guī)生化試驗。

1.2.4病原菌血清學鑒定參照程安春等的方法[5]，將分離的病原菌株純培養(yǎng)物進行平板凝集試驗：在干凈載玻片中央滴加純化水1滴，用接種環(huán)蘸取經(jīng)過離心洗滌的分離菌少許，與純化水混勻，滴加未稀釋的陽性血清1滴。將載玻片反復振蕩或用接種環(huán)涂開，注意觀察結(jié)果。幾秒鐘后出現(xiàn)清晰的乳白色絮狀凝集塊者即判定為陽性反應。陽性反應者須重復3次上述操作以減少假陽性。

1.2.5人工感染試驗將確定血清型的分離菌純化后，分別接種于加有5%小牛血清的TSB液體培養(yǎng)基上，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后進行純粹性檢驗、細菌比濁計數(shù)，活菌含量約為 10億CFU/mL。取未免疫過鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗的14日齡健康櫻桃谷鴨作為試驗對象（每組10羽）。試驗組以分離菌純培養(yǎng)物0.1 mL/羽接種，含菌數(shù)為1億CFU，第7組為對照組，接種等量的生理鹽水。接種后觀察10 d，記錄發(fā)病和死亡情況[6]。

2結(jié)果與分析

2.1細菌分離結(jié)果

試驗表明，從10例鴨疫里默氏桿菌病疑似病例的腦、心血、肝、脾等組織中分離出6株疑似菌株，依次命名為XY1、XY2、XY3、XY4、XY5、XY6。6株鴨疫里默氏桿菌分離株均呈革蘭陰性、不運動、無芽孢、單個或成雙存在、偶見長絲狀的短小桿菌，瑞氏染色呈兩極濃染，符合鴨疫里默氏桿菌的形態(tài)特征。

2.2生化試驗結(jié)果

分離菌均不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、山梨醇等碳水化合物，靛基質(zhì)試驗、甲基紅試驗、尿素酶試驗、硝酸鹽還原試驗均為陰性，不產(chǎn)生硫化氫、液化明膠、過氧化氫酶陽性?；痉哮喴呃锬蠗U菌的生化特性。

2.3血清型鑒定結(jié)果

將分離到的6株細菌分別與標準陽性血清進行平板凝集試驗，結(jié)果表明XY1、XY3均與抗鴨疫里默氏桿菌2型陽性血清發(fā)生凝集反應；XY2與抗鴨疫里默氏桿菌1型陽性血清發(fā)生凝集反應；XY4、XY5、XY6未定型。

2.4人工感染試驗結(jié)果

試驗組櫻桃谷雛鴨接菌24 h后開始出現(xiàn)精神沉郁、行動遲緩、 排綠色稀糞、共濟失調(diào)等癥狀，3～5 d全部發(fā)病死亡。剖檢死鴨發(fā)現(xiàn)，其患有或輕或重的纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎；并對死鴨進行細菌分離，結(jié)果重新分離到接種菌，并能凝集相應血清型的鴨疫里默氏桿菌。對照雛鴨均健存。

3結(jié)論與討論

目前鴨疫里默氏桿菌已呈全球性分布[7]。2002年前，學者普遍認為鴨疫里默氏桿菌有21個血清型。2003年程安春等提出4個新的血清型存在，命名為22～25型[4]。2006年張大丙等提出血清10型還存在4個亞型，并鑒定出1個變異株以及2個可能的新型菌株[8]。因此鴨疫里默氏桿菌實際存在的血清型可能更復雜，且各血清型間的交叉保護性不強[9-12]。本研究參照程安春等介紹的平板凝集方法[5]共分離鑒定出6株鴨疫里默氏桿菌，其中3株為血清1型或血清2型，另外3株未定型，說明信陽市鴨群存在包括血清1型和血清2型在內(nèi)的多種血清型感染。由于采集病料和標準菌株、標準血清的局限，其他流行的血清型有待進一步分離和鑒定。

由于該菌血清型眾多，且各地區(qū)流行的鴨疫里默氏桿菌優(yōu)勢血清型存在差異，使疫苗免疫預防效果不盡如人意，因此許多養(yǎng)殖戶紛紛放棄了疫苗轉(zhuǎn)而依靠使用藥物防治該病發(fā)生，從而導致了獸藥濫用、養(yǎng)殖成本增加以及耐藥菌株不斷增多，給食品安全帶來了很大的隱患。因此，選擇適合當?shù)匮逍偷镍喴呃锬蠗U菌菌苗或進行自家疫苗的研制是防治該病的關鍵。發(fā)病鴨群采用藥物治療時也應根據(jù)本場分離菌株的藥敏試驗結(jié)果，選擇高敏藥物，避免超量或濫用抗生素，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生，降低食品藥物殘留的風險。

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