張真真，李建增，蔣瑞瑞,2，馬巖超，蔡春霞，張露潔，郭玉潔，吉進卿，韓 露，田亞東,2，康相濤,2，韓瑞麗,2*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，鄭州 450002； 2.河南省家禽種質資源創(chuàng)新與利用重點實驗室，鄭州 450002； 3.河南省畜牧總站，鄭州 450008)

肉雞腿病問題一直是現(xiàn)代化養(yǎng)殖行業(yè)無法規(guī)避的話題。肢體內(nèi)外翻畸形(valgus-varus deformity, VVD)是一種長骨畸形病，以脛跗骨和跗趾骨發(fā)生一定角度的翻轉為特征?；疾∪怆u跛行難以接近飲食和水，嚴重的會導致死亡。VVD發(fā)病原因至今尚未闡明，前期研究發(fā)現(xiàn)，VVD肉雞的腿部骨骼存在軟骨細胞礦化障礙或延遲的現(xiàn)象。軟骨內(nèi)成骨是骨生成的兩種方式之一，而長骨的成骨方式主要是軟骨內(nèi)成骨。因此，體外分離培養(yǎng)軟骨細胞對研究VVD的發(fā)生具有十分重要的意義。軟骨細胞是軟骨組織中唯一的細胞，周圍被膠原蛋白和蛋白聚糖等一些大分子包裹，這些大分子使軟骨組織成為半固態(tài)，具有較強的抗壓性，這導致體外分離軟骨細胞存在一定的難度。體外傳代培養(yǎng)的軟骨細胞容易退變和去分化，隨著傳代次數(shù)的增多軟骨細胞形態(tài)由多邊形向長梭形發(fā)展，II型膠原表達情況隨著傳代次數(shù)增多而下降。關節(jié)軟骨被肌肉、脂肪和結締組織包裹，在體外分離細胞時如果處理不當，會出現(xiàn)其他雜細胞，比如成纖維細胞。因此，為保證體外分離出的細胞是軟骨細胞，需要對其進行鑒定。

miRNA是長度為22 nt的非編碼RNA，在轉錄水平上調(diào)控基因表達。已有多項研究表明，miRNA在疾病、生長發(fā)育、免疫應答等方面發(fā)揮重要作用。有研究顯示，miRNA在調(diào)節(jié)軟骨細胞表型中發(fā)揮作用，比如抑制miR-138可以維持軟骨的穩(wěn)態(tài)，miR-29b可以靶向抑制ColⅡa1表達，導致維持軟骨形態(tài)的膠原失衡。miR-15a是我們前期對脾測序得到的差異miRNA之一。在人類癌癥的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-15a參與了細胞分化、增殖、成熟、凋亡和血管生成等過程。此外，miR-15a參與NK細胞成熟、T細胞發(fā)育、巨噬細胞吞噬等多種免疫過程。在人類膝關節(jié)炎的相關研究中發(fā)現(xiàn)，與健康骨關節(jié)相比，miR-15a在骨關節(jié)炎中差異高表達。骨免疫學是2000年由Arron和Choi首次提出用來描述骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相互作用關系的新概念。最初研究發(fā)現(xiàn)，骨免疫學是免疫系統(tǒng)對骨骼系統(tǒng)的影響，像一些經(jīng)典的免疫調(diào)節(jié)因子-1β、-6、-7、-、-影響成骨細胞和破骨細胞的生成和活性。后來，研究者發(fā)現(xiàn)骨免疫系統(tǒng)不僅僅是免疫系統(tǒng)通過免疫細胞因子來影響骨骼的形成和發(fā)育，還發(fā)現(xiàn)骨骼系統(tǒng)也反作用于免疫系統(tǒng)。比如研究發(fā)現(xiàn)成骨細胞有助于造血干細胞向B淋巴細胞分化。骨免疫學的研究大都集中在破骨細胞、成骨細胞與免疫細胞之間，軟骨細胞在骨免疫學中的作用少有報道。有研究表明，-1β誘導軟骨細胞凋亡和代謝分解活性增加，進而導致骨關節(jié)炎的發(fā)生。miR-15a參與免疫應答和骨關節(jié)炎的發(fā)生都有報道，其對雞軟骨細胞的影響報道較少。為了探究過表達miR-15a對雞軟骨細胞的影響，為后續(xù)研究VVD的發(fā)病機制以及肉雞抗病育種提供研究依據(jù)。本研究對軟骨細胞體外分離培養(yǎng)方法進行了改良，在軟骨細胞中過表達miR-15a之后，檢測軟骨細胞標志基因、成熟分化基因以及炎性因子和凋亡因子的表達量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

胎牛血清、雙抗(青霉素+鏈霉素)、高糖培養(yǎng)基(上海逍鵬，中國)；II型膠原酶、透明質酸酶、胰蛋白酶、PBS、甲苯胺藍染液、Lipofectamine 2000(賽默斯，中國)；Trizol、反轉率試劑盒、PCR試劑盒(南京諾唯贊，中國)；CCK8試劑盒(美侖，中國); EDU試劑盒、miR-15a mimic、mimic NC(銳博，廣州，中國)。

1.2 組織樣樣品收集

分離軟骨細胞所用材料為3周齡AA肉雞。本研究所用組織樣來自唐山某養(yǎng)殖場隨機選取的6只35日齡的哈伯德肉雞(3只正常3只VVD)，頸部放血致死，收集心、肝、軟骨、脾、胸腺、胰腺、法氏囊、胸肌、腿肌樣品，液氮冷凍后放-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 雞軟骨細胞體外分離與培養(yǎng)

將雞頸部放血致死，浸泡在75%的酒精里3 min， 徹底消毒。將雞腿從股骨關節(jié)處完整的從軀體上取下，清理被毛后噴灑75%的酒精放進自封袋中。在超凈臺靠近酒精燈火焰處從股骨和脛骨的關節(jié)處剖開，去除軟骨組織周圍的脂肪和結締組織，將軟骨組織削成透明薄片，并用含有2%雙抗的高糖培養(yǎng)基沖洗3遍。用眼科剪將其充分剪碎(注意保持濕潤)，加2倍體積的胰蛋白酶，5% CO、37 ℃細胞培養(yǎng)箱消化30 min，每隔15 min再次進行充分剪碎。棄胰蛋白酶，添加軟骨組織2倍體積的0.2%的Ⅱ型膠原酶和0.1%透明質酸酶，之后在5% CO、37 ℃細胞培養(yǎng)箱消化8～12 h。加完全培養(yǎng)基終止消化，依次100目、200目細胞篩過濾消化液，將濾液1 500 r·min離心15 min，完全培養(yǎng)基重懸，重復3次離心。將重懸細胞接種在25 cm的細胞培養(yǎng)瓶中，5% CO和37 ℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),每隔48 h換一次培養(yǎng)液。

1.4 雞軟骨細胞鑒定

1.4.1 軟骨細胞形態(tài)觀察及甲苯胺藍染色 細胞完全貼壁后通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。將細胞在放有蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)至80%時，PBS清洗3次， 加4%的多聚甲醛，4 ℃固定30 min。PBS清洗3次，滴加70%乙醇室溫固定20 min。PBS清洗3遍， 滴加0.04%甲苯胺藍染液室溫染色30 min。無水乙醇快速漂洗一次，晾干封片，倒置顯微鏡觀察記錄。

1.4.2 軟骨細胞標志物檢測 軟骨細胞可以分泌大量的Ⅱ型膠原和蛋白聚糖，以維持細胞形態(tài)。Ⅹ型膠原是肥大化即將鈣化的軟骨細胞所特有的物質。原代軟骨細胞培養(yǎng)至80%～90%時，加Trizol，放-80 ℃保存?zhèn)溆?。PCR電泳檢測軟骨細胞分泌物蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，以及軟骨細胞肥大化標志物Ⅹ型膠原。PCR引物以及程序參照郭亞蘋的研究。

1.5 軟骨細胞的傳代培養(yǎng)與鋪板

當原代細胞培養(yǎng)至融合度為80%～90%時，倒掉舊培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍，向培養(yǎng)瓶中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1 min，向培養(yǎng)瓶中加入2 mL的完全培養(yǎng)基終止消化。所得液體轉移至15 mL離心管中，1 000 r·min離心3 min，丟棄上清，完全培養(yǎng)基重懸細胞，按照一定密度，將軟骨細胞接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)。

1.6 軟骨細胞轉染miR-15a mimics

當培養(yǎng)板中的軟骨細胞培養(yǎng)至融合度為50%～60%時，棄去舊培養(yǎng)基，PBS清洗一次，添加雙無培養(yǎng)基進行饑餓處理，用Lipofectamine 2000進行miR-15a mimics 和mimics NC轉染。轉染4～6 h后更換培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基。

1.7 CCK8法檢測軟骨細胞活力和EDU細胞增殖檢測

軟骨細胞接種在96孔板中，對F1、F2代軟骨細胞每隔12 h進行細胞活力檢測。轉染miR-15a mimics和mimics NC后的軟骨細胞，每隔12 h用CCK8法檢測細胞活力。每孔添加10 μL的CCK8，在細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀在450 nm波長處檢測吸光度值(OD)。在軟骨細胞轉染miR-15a mimics和mimics NC 36 h后，按照EDU使用說明書進行染色，熒光顯微鏡對EDU染色細胞成像并計數(shù)。

1.8 總RNA提取及cDNA合成

軟骨細胞轉染miR-15a mimics和mimics NC成功后培養(yǎng)48 h，棄去舊培養(yǎng)基，4 ℃預冷PBS清洗后，添加Trizol放在-80 ℃保存用于RNA提取。收集的組織樣和細胞按照RNAiso plus試劑說明書提取RNA。按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 實時熒光定量PCR

根據(jù)NCBI公布的基因序列進行引物設計，基因引物由尚亞生物技術公司合成，miR-15a和6的引物購自廣州銳博，引物序列見表1。PCR反應體系為10 μL，定量PCR程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s,進行40個循環(huán)。以6為內(nèi)參，測定miR-15a的表達量。以為內(nèi)參，測定軟骨細胞標志基因Ⅱ型膠原(-2)、蛋白聚糖()、Ⅹ型膠原(-10)，軟骨發(fā)育成熟基因2、9、、9，炎性因子-1β、-6、-8、-10、-、-3以及凋亡因子、、-2的表達量。采用相對定量2法對定量數(shù)據(jù)進行分析。

表1 引物序列信息

1.10 miR-15a靶基因預測與驗證

通過軟件預測miR-15a與基因5的結合位點。構建含有結合位點的5基因3′UTR野生型和突變型載體。當細胞達到60%～70%時，共轉染miR-15a mimics、mimics NC以及5的野生型和突變型載體，48 h后根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega)說明書進行靶向關系驗證。

1.11 數(shù)據(jù)分析

該試驗所得數(shù)據(jù)通過SPSS 24.0進行獨立樣本檢驗顯著性分析，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 軟骨細胞體外分離培養(yǎng)觀察

通過倒置顯微鏡觀察到未貼壁的細胞為發(fā)光圓形，原代軟骨細胞接種到培養(yǎng)瓶中3 h開始貼壁，8 h 后75%的細胞貼壁，12 h完全貼壁，貼壁細胞為折光性較強的圓形、四方形或多邊形，當原代軟骨細胞完全融合后呈鋪路石狀(圖1)。F1、F2、F3代細胞形態(tài)多為多邊形，F(xiàn)4代軟骨細胞形態(tài)開始出現(xiàn)梭形和長條狀的成纖維樣細胞(圖2)。

2.2 軟骨細胞鑒定與細胞生長曲線

對軟骨細胞標志基因進行PCR和凝膠電泳分析，結果如圖3A所示，瓊脂糖凝膠圖顯示，II型膠原和蛋白聚糖片段分別為248、155 bp，符合預期，且X型膠原并未顯示，說明該細胞具有正常軟骨細胞的特性和生理。軟骨細胞能夠大量分泌粘多糖和蛋白多糖，甲苯胺藍染液能將酸性粘多糖染成藍紫色。如圖3B所示，細胞核被染成深藍色，細胞質周圍有藍紫色顆粒物質，說明該細胞大量分泌粘多糖。用CCK8分析法繪制F1、F2代生長曲線，結果如圖3C所示，軟骨細胞F1代和F2代細胞在96 h之前穩(wěn)定而快速增殖，96 h后生長速度開始下降。F2代軟骨細胞能夠快速而穩(wěn)定增殖，且細胞形態(tài)完好，綜合考慮選用F2代細胞進行后續(xù)試驗。

A. 原代軟骨細胞培養(yǎng)24 h(100×); B. 原代軟骨細胞培養(yǎng)48 h(100×); C. 原代軟骨細胞培養(yǎng)72 h(200×)A. Primary chondrocytes were cultured for 24 h(100×); B. Primary chondrocytes were cultured for 48 h(100×); C. Primary chondrocytes were cultured for 72 h(200×)圖1 原代軟骨細胞倒置顯微鏡形態(tài)觀察Fig.1 The morphological observation of the original generation of chondrocytes under inverted microscope

A.F4代軟骨細胞培養(yǎng)12 h(100×); B. F4代軟骨細胞培養(yǎng)48 h(100×)A. F4 generation chondrocytes were cultured for 12 h(100×); B. F4 generation chondrocytes were cultured for 48 h(100×)圖2 F4代軟骨細胞倒置顯微鏡形態(tài)觀察Fig.2 Morphological observation of F4 generation chondrocytes under inverted microscope

A. PCR擴增電泳圖; B. 甲苯胺藍染色(100×); C. F1、F2代軟骨細胞生長曲線A. PCR amplification electrophoresis; B. Toluidine blue staining(100×); C. Growth curve of F1 and F2 generation chondrocytes圖3 軟骨細胞鑒定和生長曲線Fig.3 Chondrocytes identification and growth curve

2.3 miR-15a組織表達譜

通過熒光定量PCR檢測miR-15a在各組織的表達情況。結果如圖4所示，miR-15a在各組織都有表達，與健康組相比，miR-15a在VVD組的肝(<0.01)、 脾(<0.05)和胸腺(<0.01)的表達量顯著升高，心和胸肌組織中miR-15a的表達量顯著下降(<0.01)。

2.4 過表達miR-15a對軟骨細胞的影響

軟骨細胞過表達miR-15a后檢測細胞增殖情況，結果如圖5所示。CCK8結果顯示，與NC組相比，過表達miR-15a組軟骨細胞增殖率顯著降低(<0.01，圖5A)。EDU結果顯示，過表達miR-15a組軟骨細胞增殖數(shù)量顯著下降(<0.01,圖5B、C)。qPCR檢測軟骨細胞標志基因表達量，如圖6A所示，過表達組II型膠原、蛋白聚糖、X型膠原表達量都低于NC組，其中蛋白聚糖差異顯著(<0.05)。檢測軟骨成熟分化基因發(fā)現(xiàn)2和9基因的表達量mimics組極顯著低于NC組(<0.01， 圖6B)。與NC組相比，過表達miR-15a組的基因極顯著升高(<0.01)，極顯著降低(<0.01)，抗凋亡基因-2表達量極顯著降低(<0.01,圖6D)。結果提示，過表達miR-15a可以抑制軟骨細胞增殖，抑制軟骨細胞分泌標志物的能力，抑制軟骨細胞成熟和分化，并促進軟骨細胞凋亡。

*.差異顯著(P<0.05); **.差異極顯著(P<0.01);下同*. Significant difference (P<0.05); * *. Extremely significant difference (P<0.01);The same as below圖4 miR-15a在不同組織中的相對表達水平Fig.4 Relative expression levels of miR-15a in different tissues

A. CCK8測定細胞增殖; B,C. EDU測定細胞增殖(圖C, 100×)A. Cell proliferation was determined by CCK8; B, C. EDU to determine cell proliferation(figure C,100×)圖5 miR-15a抑制軟骨細胞增殖Fig.5 miR-15a inhibits chondrocytes proliferation

A. 軟骨細胞標志基因; B. 成熟分化基因; C. 炎癥因子; D. 凋亡因子A. Chondrocyte marker genes; B. Mature differentiated genes; C. Inflammatory cytokines; D. Apoptosis factor圖6 軟骨細胞轉染miR-15a mimics后各基因表達水平Fig.6 Expression level of related genes after miR-15a mimics transfected into chondrocytes

2.5 miR-15a靶基因篩選與驗證

通過軟件預測到miR-15a的種子區(qū)與5的3′UTR有穩(wěn)定結合位點(圖7A)。初步驗證兩者靶向關系，結果顯示(圖7B)，軟骨細胞成功過表達miR-15a后，發(fā)現(xiàn)miR-15a表達量顯著升高而5表達量顯著降低(<0.01)。為進一步驗證兩者的靶向關系，成功構建了有結合位點的5的3′UTR的野生型(5-WT)和突變型(5-Mut)載體。軟骨細胞共轉染miR-15a mimics、mimics NC、5野生型質粒、突變型質粒48 h后進行雙熒光素酶檢測報告。結果顯示，miR-15a mimics+5-WT組的熒光活性顯著提高，表明miR-15a與5在雞軟骨細胞中沒有靶向關系(圖7C)。而當過表達miR-15a時，5表達量下降的原因可能是兩者之間存在其他調(diào)控方式。

A. FKBP5與miR-15a結合位點; B. 軟骨細胞初步驗證靶向關系; C. 雙熒光素酶檢測系統(tǒng)驗證靶向關系A. FKBP5 binding site with miR-15a; B. Chondrocytes preliminarily verified the targeting relationship; C. Validation of targeted relationship by double-luciferase detection reporter system圖7 miR-15a與FKBP5靶向關系驗證Fig.7 Verification of the targeting relationship between miR-15a and FKBP5

3 討 論

VVD的發(fā)病機制至今尚未闡明，在此前的研究中發(fā)現(xiàn)VVD病雞存在軟骨細胞礦化障礙的現(xiàn)象。體外分離培養(yǎng)軟骨細胞對研究VVD的發(fā)生有重要意義。軟骨細胞是軟骨組織中存在的唯一細胞。軟骨細胞被豐富的膠原纖維蛋白和蛋白聚糖包裹，很難被消化分離出軟骨細胞。本試驗用3種酶對軟骨組織進行消化，且在消化時增大軟骨組織與酶的接觸面積，使得軟骨細胞大量游離出來。軟骨細胞作為軟骨組織中唯一的細胞，由于軟骨組織內(nèi)沒有血管，營養(yǎng)物質通過滲透作用進入軟骨組織中，進而被軟骨細胞吸收，這成為體外軟骨細胞培養(yǎng)的依據(jù)。本研究分離出的軟骨細胞數(shù)量較多，經(jīng)過觀察和鑒定得到體態(tài)、生理特征和生物學特性良好，且可以穩(wěn)定傳至F4代的軟骨細胞。當軟骨細胞傳到F4代時，軟骨細胞呈現(xiàn)長梭形，出現(xiàn)明顯去分化現(xiàn)象。綜合生長曲線、細胞生長狀態(tài)等多種因素考慮，選擇生長速度穩(wěn)定、狀態(tài)良好的F2代軟骨細胞進行后續(xù)試驗。

骨免疫學是強調(diào)骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)關系的概念。隨著深入研究，學者發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)相互作用維護機體平衡。比如免疫系統(tǒng)通過T細胞、B細胞等分泌的細胞因子直接作用于骨骼系統(tǒng)，骨細胞也可以反過來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。我們希望找到一些在免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)兩者之間發(fā)揮重要作用的關鍵基因，并對其進行研究，期待為VVD的研究和抗病育種提供參考依據(jù)。通過前人的研究，我們了解到miR-15a在骨骼疾病和免疫功能等方面發(fā)揮重要作用。比如Wei等發(fā)現(xiàn)，miR-15a與5靶向結合促進炎癥發(fā)生和細胞遷徙。顏世舉發(fā)現(xiàn)，在關節(jié)炎軟骨細胞中miR-15a顯著高表達；他還發(fā)現(xiàn)軟骨細胞過表達miR-15a可以抑制軟骨細胞的增殖，促進細胞凋亡；過表達miR-15a抑制II型膠原的合成，影響軟骨基質的完整性，從而促進骨關節(jié)炎發(fā)病。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a在VVD組雞的軟骨中低表達，揭示miR-15a在VVD中的作用機制可能與其在骨關節(jié)炎中的作用機制不同。本研究通過檢測過表達miR-15a對軟骨細胞的標志基因、炎性細胞因子以及凋亡基因表達的影響，初步探究了miR-15a對軟骨細胞的影響。研究發(fā)現(xiàn)，雞軟骨細胞過表達miR-15a后，II型膠原、蛋白聚糖、X型膠原表達量有所下降，其中蛋白聚糖顯著下降(<0.05)。蛋白聚糖影響軟骨細胞的黏附、遷移能力，且對軟骨細胞增殖分化起著重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞過表達miR-15a后，成熟分化基因2、9表達量顯著下降(<0.05)，極顯著升高，較NC組表達量極顯著降低(<0.01)，抗凋亡因子-2顯著下降(<0.05)。軟骨細胞的凋亡機制涉及到Caspas家族、P53和Bcl-2家族等多種凋亡途徑，而-2是凋亡中最常見的終末通路。與兩者結合可促進細胞凋亡，一般作用于誘導階段。有研究表明，與的凋亡誘導過程與-2的表達有一定的關系，-2可以抑制或阻斷介導的凋亡。本試驗發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞過表達miR-15a后，表達量極顯著升高，較NC組表達量極顯著降低(<0.01)，抗凋亡因子-2極顯著下降(<0.05)。提示誘導凋亡機制與-2凋亡機制可能在過表達miR-15a導致軟骨細胞凋亡的過程中發(fā)揮作用，具體機制有待進一步研究。

4 結 論

本試驗通過改良軟骨細胞體外分離方法成功獲得了狀態(tài)和生理特性良好的軟骨細胞。綜合試驗結果發(fā)現(xiàn)，過表達miR-15a抑制軟骨細胞的增殖、成熟和分化并促進細胞凋亡，為后續(xù)研究肉雞VVD發(fā)病機制和肉雞抗病育種提供了參考依據(jù)。