翁琴云++++++張建梅++++++朱滏++++++游小偉++++++陳澤輝++++++黃建煒

[摘要] 目的 分析2005～2011年25起食物中毒標(biāo)本中分離的108株副溶血性弧菌的血清型分布、tdh基因攜帶情況和PFGE分型特征。 方法 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)菌株的血清型別；實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)耐熱直接溶血素（tdh）基因；脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）和 BioNumerics軟件對(duì)菌株進(jìn)行分子分型分析。 結(jié)果 108株菌分為7個(gè)血清群、15個(gè)血清型，主要血清型是O3∶K6；所有菌株分成65個(gè)PFGE types（PT），相似度為34.1%～100.0%；92株菌攜帶tdh基因，陽性率為85.2%。 結(jié)論 引起廈門市食物中毒的副溶血性弧菌血清型分布呈多樣性，優(yōu)勢(shì)血清型為O3∶K6，且大部分菌株具有tdh基因；同一克隆的菌株血清型可相同也可不同。

[關(guān)鍵詞] 食物中毒；副溶血性弧菌；血清型；tdh；PCR；PFGE

[中圖分類號(hào)] R155.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）07（a）-0004-05

副溶血性弧菌是引起食源性疾病的重要海洋微生物，是沿海城市食物中毒最常見的致病菌之一[1-4]。隨著交通運(yùn)輸工具的發(fā)展，內(nèi)地城市也出現(xiàn)了副溶血性弧菌引起的食物中毒事件[5]。

美國(guó)CDC通過食源性疾病主動(dòng)監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)也發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌引起的食物中毒有逐漸上升的趨勢(shì)[6]。廈門是一個(gè)港口城市，微生物引起的食物中毒事件絕大多數(shù)都是由副溶血性弧菌導(dǎo)致的，從2005年到現(xiàn)在，已經(jīng)從食物中毒樣本中分離鑒定并保存了100多株副溶血性弧菌。本研究分析這些菌株的血清型別、主要毒力基因以及PFGE分型數(shù)據(jù)，以了解多年來本地區(qū)中毒菌株的病原菌分子流行病學(xué)特征，便于與各地優(yōu)勢(shì)流行菌型的比較和揭示其流行與發(fā)展趨勢(shì)的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 副溶血性弧菌來自2005～2011年廈門市25起食物中毒分離的菌株，其中來源于患者的糞便或肛拭子的菌株有99株，來源于食品清洗加工材料（菜刀、抹布、砧板）拭子的菌株有4株，來源于可疑食品的有5株。標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC 21617），沙門菌H9812為中國(guó)CDC提供。

1.1.2 主要的試劑與培養(yǎng)基 CHROMagarTM弧菌顯色培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京陸橋），副溶血性弧菌診斷血清（Tianjin Biochip Co.），蛋白酶K（Amresco，美國(guó)）、內(nèi)切酶SfiⅠ和XbaⅠ（NEB，美國(guó)），Seakem Gold Agar（Lonza，美國(guó)），DNA染色劑GelRed（Biotium，美國(guó)）；副溶血性弧菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒（Zeesan，廈門）。

1.1.3 儀器 熒光PCR儀CFX-96、脈沖凝膠電泳儀CHEFmapper和凝膠成像系統(tǒng)GelDocXR+（Bio-Rad，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 血清分型 按照副溶血性弧菌診斷血清使用說明書要求，對(duì)菌株的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物以玻片凝集試驗(yàn)確定O抗原、K抗原型別，K抗原不凝集者定為K無法分型，用KUT表示。

1.2.2 toxR和tdh基因的檢測(cè) 菌株DNA的提取及反應(yīng)體系的配置按照副溶血性弧菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min預(yù)變性后，94℃ 15 s，55℃ 40 s，72℃ 15 s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)；同時(shí)檢測(cè)toxR和tdh基因。

1.2.3 PFGE分型 按照PulseNet China的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行操作。簡(jiǎn)要程序如下：制備4.2 MCF（麥?zhǔn)隙龋┑木鷳乙海裰瞥赡z塊裂解、SfiI酶切，上樣電泳后GelRed染色，拍攝圖像。電泳參數(shù)：低分子量設(shè)為78 kb，高分子量設(shè)為396 kb，電泳時(shí)間為19 h，脈沖時(shí)間為10～35.03 s，電泳緩沖液加入終濃度為3.8 μg/L的硫脲。菌株的PFGE圖像以BioNumerics 6.6進(jìn)行聚類分析（UPGMA），用Dice 系數(shù)來評(píng)估PFGE 結(jié)果。分子量參考菌株為沙門菌H9812。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)分型結(jié)果

從25起食物中毒事件標(biāo)本分離108株副溶血弧菌，抗原分型結(jié)果見表1，O抗原包括O1、O2、O3、O4、O5、O8和O10等7個(gè)型別，其中O3群54株、O1群26株、O4群19株；K抗原可以分為13個(gè)型別，K6是優(yōu)勢(shì)型別（51株）； O3∶K6血清型是優(yōu)勢(shì)血清型（51株）。

分析25起食物中毒的病原菌血清型別，13起由單一的血清型引起，其余均為混合感染；由O3∶K6血清型或與其他血清型混合感染導(dǎo)致的共16起，由O4∶K8或與其他血清型混合感染導(dǎo)致的共5起。O1∶K25血清型僅在2005年出現(xiàn)過，在隨后6年的食物中毒中均沒有檢出（表2）。

2.2 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)108株菌的toxR都為陽性，從種特異性基因確認(rèn)為副溶血性弧菌，其中92株tdh+和16株tdh-，85.2%的菌株為產(chǎn)毒菌株；來源于患者的99株菌中有89株攜帶tdh基因，陽性率為89.9%，另外從來源于菜刀、抹布及一份食物中分離的3株菌也檢測(cè)到tdh基因（表2）。

2.3 PFGE分型結(jié)果

將108株菌被限制性內(nèi)切酶SfiI切出65個(gè)PFGE types（PT），酶切條帶數(shù)為14～20。用BioNumerics6.6軟件對(duì)酶切圖譜進(jìn)行聚類分析，各帶型相似系數(shù)為34.1%～100.0%。主要為A、B、C 3個(gè)群， B群為優(yōu)勢(shì)型別，包括69株菌（63.89%），其帶型相似度為78.3%～100.0%，B群又包含兩個(gè)亞群，其相似率達(dá)87.2%（圖1），對(duì)應(yīng)的血清型主要是O3∶K6、O4∶K68和O1∶K25。

分別對(duì)O1、O3和O4群的菌株（26、54、19 株）聚類分析發(fā)現(xiàn)，血清型別相同的菌株P(guān)FGE帶型相似度高，不同血清型菌株間差異較大（圖2），血清分型與PFGE分型的結(jié)果有較好的相關(guān)性；O3群菌株主要的血清型是O3∶K6，2009年之前和之后分離的菌株可定義為兩個(gè)PT亞群，其相似度為87.5%，有4～6個(gè)條帶差異，差異主要集中在大小為244.4～336.5 kb的條帶。

3 討論

2005～2011年廈門地區(qū)食物中毒副溶血性弧菌的主要流行菌型為O3∶K6、O4∶K8，這7年25起食物中毒事件的標(biāo)本中分別有 16 和 5 起分離到菌株，而且?guī)缀趺磕甓加?，這與國(guó)內(nèi)黃彥等[7]的報(bào)道類似。部分菌株（KUT）K抗原未能分型，可能是菌株在保存尤其是常溫保存的過程中抗原表達(dá)或基因位點(diǎn)發(fā)生變異，或者現(xiàn)有分型血清種類的局限，例如第 20 起（2010年8月）食物中毒事件額標(biāo)本分離到 7株菌，有兩株為KUT，但在隨后PFGE分型中帶型高度一致，達(dá)97.3%，與其余5株菌最多僅有3個(gè)條帶的差異，可能是在K抗原編碼基因內(nèi)發(fā)生了個(gè)別酶切位點(diǎn)的變異，但根據(jù) Tenover等[8]的判斷原則，這些菌株屬于相同的克隆群。

副溶血性弧菌的毒力基因雖然不僅包括tdh，還包括trh、毒力島等，但其tdh編碼的耐熱直接溶血素是與致病力最為密切的相關(guān)致病因子，而在本實(shí)驗(yàn)中89.9%的患者菌株都攜帶tdh基因，也恰好印證了這一觀點(diǎn)。雖然Ottaviani等[9]報(bào)道了不帶毒力基因的副溶血性弧菌引起的食物中毒事件，但是在國(guó)內(nèi)大部分的暴發(fā)事件分離到的菌株中毒力基因的攜帶率達(dá)到了85%以上[9]，所以在食物中毒事件暴發(fā)時(shí)，除了對(duì)樣品進(jìn)行病原菌檢測(cè)外，檢測(cè)tdh等毒力基因有利于分析和確認(rèn)中毒事件的病原。

在25起食物中毒中，單一血清型感染和混合血清型感染各占一半左右，這種多血清型混合感染的食物中毒事件也常有報(bào)道[10-14]，然而同一起食物中毒中分離到的菌株有可能是患者自身攜帶的，也有可能是食品標(biāo)本中存在的非致病菌，要驗(yàn)證其是否與暴發(fā)相關(guān)則需要采用其他方法進(jìn)一步分析。本文以PFGE同源性分析，B群為PFGE分型的優(yōu)勢(shì)型別，O3∶K6血清型占大部分，O4∶K68、O1∶K25及部分 O4∶K8、O1∶KUT菌株也同屬于這個(gè)群，且菌株間相似度較高，這表明這些菌株有著較高的同源性，極有可能是來自于同一個(gè)菌株克隆，即 O3∶K6克隆群，而國(guó)外也報(bào)道了自1995年分離到O3∶K6株已經(jīng)形成了包括O3∶K6及其衍生血清型的O3∶K6克隆群，其中就涵蓋了上述血清型[15]。在第4起和第11起食物中毒中，廚具或食品分離株與患者分離株有著相似度達(dá)97.3%的帶型；而同時(shí)檢出多種血清型的其他事件中，非臨床標(biāo)本來源的菌株與患者分離株帶型相似度較低，說明中毒事件可能僅與其中的一個(gè)血清型相關(guān)，而其他血清型（特別是tdh-）菌株可能不是致病原因。

此外，單獨(dú)對(duì)O3群菌株進(jìn)行聚類分析可以得到相似度較高但年代分布不同的兩個(gè)群，說明廈門這幾年來引起食物中毒的主要菌株一直是源于本地，只是該型菌2009年后發(fā)生了2～3個(gè)酶切位點(diǎn)變異。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 羅賢如，黃薇，張錦周，等.深圳市2006～2010 年食物中毒情況分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40（12）：2231-2233.

[2] 李孝權(quán)，李釧華，鄧志愛，等.廣州地區(qū)七年細(xì)菌性食物中毒的病原特征研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（3）：622-624.

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[7] 黃彥，唐振柱，李秀桂，等.我國(guó)食物中毒副溶血性弧菌流行株血清型及分子分型現(xiàn)況[J].職業(yè)與健康，2013，29（8）：998-1000.

[8] Tenover FC，Arbeit RD，Goering RV，et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis： criteria for bacterial strain typing[J].J Clin Microbiol，1995，33（9）：2233-2239.

[9] Ottaviani D，Leoni F，Serra R，et al.Nontoxigenic Vibrio parahaemolyticus strains causing acute gastroenteritis[J].J Clin Microbiol，2012，50（12）：4141-4143.

[10] 方偉.2004～2007年廣東省副溶血弧菌血清分型、分子特征及溯源研究[D].廣州：暨南大學(xué)，2009.

[11] 李婧.我國(guó)部分地區(qū)不同來源副溶血弧菌的分子分型及遺傳變異研究[D].北京：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2012.

[12] 孫永祥，丁水軍，羅蕓.PFGE法分析多血清型副溶血性弧菌引起的食物中毒[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（10）：2444-2445.

[13] 鄧冬云，梁景濤，楊啟，等.多型別副溶血性弧菌引起的食物中毒病原學(xué)分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22（4）：776-780.

[14] 帥慧群，張睿，詹麗.多血清型副溶血性弧菌引起食物中毒的毒力基因檢測(cè)和分子分型[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（18）：3524-3529.

[15] Nair GB，Ramamurthy T，Bhattacharya SK，et al.Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3∶K6 and its serovariants[J].Clin Microbiol Rev，2007，20（1）：39-48.

（收稿日期：2014-05-05 本文編輯：許俊琴）

3 討論

2005～2011年廈門地區(qū)食物中毒副溶血性弧菌的主要流行菌型為O3∶K6、O4∶K8，這7年25起食物中毒事件的標(biāo)本中分別有 16 和 5 起分離到菌株，而且?guī)缀趺磕甓加?，這與國(guó)內(nèi)黃彥等[7]的報(bào)道類似。部分菌株（KUT）K抗原未能分型，可能是菌株在保存尤其是常溫保存的過程中抗原表達(dá)或基因位點(diǎn)發(fā)生變異，或者現(xiàn)有分型血清種類的局限，例如第 20 起（2010年8月）食物中毒事件額標(biāo)本分離到 7株菌，有兩株為KUT，但在隨后PFGE分型中帶型高度一致，達(dá)97.3%，與其余5株菌最多僅有3個(gè)條帶的差異，可能是在K抗原編碼基因內(nèi)發(fā)生了個(gè)別酶切位點(diǎn)的變異，但根據(jù) Tenover等[8]的判斷原則，這些菌株屬于相同的克隆群。

副溶血性弧菌的毒力基因雖然不僅包括tdh，還包括trh、毒力島等，但其tdh編碼的耐熱直接溶血素是與致病力最為密切的相關(guān)致病因子，而在本實(shí)驗(yàn)中89.9%的患者菌株都攜帶tdh基因，也恰好印證了這一觀點(diǎn)。雖然Ottaviani等[9]報(bào)道了不帶毒力基因的副溶血性弧菌引起的食物中毒事件，但是在國(guó)內(nèi)大部分的暴發(fā)事件分離到的菌株中毒力基因的攜帶率達(dá)到了85%以上[9]，所以在食物中毒事件暴發(fā)時(shí)，除了對(duì)樣品進(jìn)行病原菌檢測(cè)外，檢測(cè)tdh等毒力基因有利于分析和確認(rèn)中毒事件的病原。

在25起食物中毒中，單一血清型感染和混合血清型感染各占一半左右，這種多血清型混合感染的食物中毒事件也常有報(bào)道[10-14]，然而同一起食物中毒中分離到的菌株有可能是患者自身攜帶的，也有可能是食品標(biāo)本中存在的非致病菌，要驗(yàn)證其是否與暴發(fā)相關(guān)則需要采用其他方法進(jìn)一步分析。本文以PFGE同源性分析，B群為PFGE分型的優(yōu)勢(shì)型別，O3∶K6血清型占大部分，O4∶K68、O1∶K25及部分 O4∶K8、O1∶KUT菌株也同屬于這個(gè)群，且菌株間相似度較高，這表明這些菌株有著較高的同源性，極有可能是來自于同一個(gè)菌株克隆，即 O3∶K6克隆群，而國(guó)外也報(bào)道了自1995年分離到O3∶K6株已經(jīng)形成了包括O3∶K6及其衍生血清型的O3∶K6克隆群，其中就涵蓋了上述血清型[15]。在第4起和第11起食物中毒中，廚具或食品分離株與患者分離株有著相似度達(dá)97.3%的帶型；而同時(shí)檢出多種血清型的其他事件中，非臨床標(biāo)本來源的菌株與患者分離株帶型相似度較低，說明中毒事件可能僅與其中的一個(gè)血清型相關(guān)，而其他血清型（特別是tdh-）菌株可能不是致病原因。

此外，單獨(dú)對(duì)O3群菌株進(jìn)行聚類分析可以得到相似度較高但年代分布不同的兩個(gè)群，說明廈門這幾年來引起食物中毒的主要菌株一直是源于本地，只是該型菌2009年后發(fā)生了2～3個(gè)酶切位點(diǎn)變異。

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[3] 黃芳，許少洪，李映霞，等.2009-2012年海珠區(qū)副溶血性弧菌食物中毒特征分析[J].中國(guó)公共衛(wèi)生管理，2013， 29（5）：604-605.

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[9] Ottaviani D，Leoni F，Serra R，et al.Nontoxigenic Vibrio parahaemolyticus strains causing acute gastroenteritis[J].J Clin Microbiol，2012，50（12）：4141-4143.

[10] 方偉.2004～2007年廣東省副溶血弧菌血清分型、分子特征及溯源研究[D].廣州：暨南大學(xué)，2009.

[11] 李婧.我國(guó)部分地區(qū)不同來源副溶血弧菌的分子分型及遺傳變異研究[D].北京：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2012.

[12] 孫永祥，丁水軍，羅蕓.PFGE法分析多血清型副溶血性弧菌引起的食物中毒[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（10）：2444-2445.

[13] 鄧冬云，梁景濤，楊啟，等.多型別副溶血性弧菌引起的食物中毒病原學(xué)分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22（4）：776-780.

[14] 帥慧群，張睿，詹麗.多血清型副溶血性弧菌引起食物中毒的毒力基因檢測(cè)和分子分型[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（18）：3524-3529.

[15] Nair GB，Ramamurthy T，Bhattacharya SK，et al.Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3∶K6 and its serovariants[J].Clin Microbiol Rev，2007，20（1）：39-48.

（收稿日期：2014-05-05 本文編輯：許俊琴）

3 討論

2005～2011年廈門地區(qū)食物中毒副溶血性弧菌的主要流行菌型為O3∶K6、O4∶K8，這7年25起食物中毒事件的標(biāo)本中分別有 16 和 5 起分離到菌株，而且?guī)缀趺磕甓加?，這與國(guó)內(nèi)黃彥等[7]的報(bào)道類似。部分菌株（KUT）K抗原未能分型，可能是菌株在保存尤其是常溫保存的過程中抗原表達(dá)或基因位點(diǎn)發(fā)生變異，或者現(xiàn)有分型血清種類的局限，例如第 20 起（2010年8月）食物中毒事件額標(biāo)本分離到 7株菌，有兩株為KUT，但在隨后PFGE分型中帶型高度一致，達(dá)97.3%，與其余5株菌最多僅有3個(gè)條帶的差異，可能是在K抗原編碼基因內(nèi)發(fā)生了個(gè)別酶切位點(diǎn)的變異，但根據(jù) Tenover等[8]的判斷原則，這些菌株屬于相同的克隆群。

副溶血性弧菌的毒力基因雖然不僅包括tdh，還包括trh、毒力島等，但其tdh編碼的耐熱直接溶血素是與致病力最為密切的相關(guān)致病因子，而在本實(shí)驗(yàn)中89.9%的患者菌株都攜帶tdh基因，也恰好印證了這一觀點(diǎn)。雖然Ottaviani等[9]報(bào)道了不帶毒力基因的副溶血性弧菌引起的食物中毒事件，但是在國(guó)內(nèi)大部分的暴發(fā)事件分離到的菌株中毒力基因的攜帶率達(dá)到了85%以上[9]，所以在食物中毒事件暴發(fā)時(shí)，除了對(duì)樣品進(jìn)行病原菌檢測(cè)外，檢測(cè)tdh等毒力基因有利于分析和確認(rèn)中毒事件的病原。

在25起食物中毒中，單一血清型感染和混合血清型感染各占一半左右，這種多血清型混合感染的食物中毒事件也常有報(bào)道[10-14]，然而同一起食物中毒中分離到的菌株有可能是患者自身攜帶的，也有可能是食品標(biāo)本中存在的非致病菌，要驗(yàn)證其是否與暴發(fā)相關(guān)則需要采用其他方法進(jìn)一步分析。本文以PFGE同源性分析，B群為PFGE分型的優(yōu)勢(shì)型別，O3∶K6血清型占大部分，O4∶K68、O1∶K25及部分 O4∶K8、O1∶KUT菌株也同屬于這個(gè)群，且菌株間相似度較高，這表明這些菌株有著較高的同源性，極有可能是來自于同一個(gè)菌株克隆，即 O3∶K6克隆群，而國(guó)外也報(bào)道了自1995年分離到O3∶K6株已經(jīng)形成了包括O3∶K6及其衍生血清型的O3∶K6克隆群，其中就涵蓋了上述血清型[15]。在第4起和第11起食物中毒中，廚具或食品分離株與患者分離株有著相似度達(dá)97.3%的帶型；而同時(shí)檢出多種血清型的其他事件中，非臨床標(biāo)本來源的菌株與患者分離株帶型相似度較低，說明中毒事件可能僅與其中的一個(gè)血清型相關(guān)，而其他血清型（特別是tdh-）菌株可能不是致病原因。

此外，單獨(dú)對(duì)O3群菌株進(jìn)行聚類分析可以得到相似度較高但年代分布不同的兩個(gè)群，說明廈門這幾年來引起食物中毒的主要菌株一直是源于本地，只是該型菌2009年后發(fā)生了2～3個(gè)酶切位點(diǎn)變異。

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（收稿日期：2014-05-05 本文編輯：許俊琴）