翟麗維，趙延輝，李文軍，邢 凱*，王楚端*

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193； 2. 北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；3. 北京三元種業(yè)科技股份有限公司，北京 100029)

豬脂肪沉積性狀是生豬生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟性狀。豬脂肪沉積的多少直接影響其生長速度、飼料轉(zhuǎn)化效率、瘦肉率、肉品質(zhì)和繁殖性能。相比于小鼠等模式動物，豬與人類有著更為相近的體重、消化系統(tǒng)、沉脂能力等解剖學(xué)或生理學(xué)特征。豬也成為研究人類肥胖癥、糖尿病、代謝紊亂癥等疾病的良好醫(yī)學(xué)模型。因此，鑒定影響豬脂肪沉積的關(guān)鍵基因一直是科研界的熱點。

脂肪沉積在豬體內(nèi)是一個動態(tài)的過程，包括了脂肪的合成、分解和轉(zhuǎn)運等過程。脂肪組織、肝和肌肉組織是脂肪合成和分解的主要場所，是調(diào)控脂肪沉積的關(guān)鍵部位。豬脂肪組織是儲存甘油三酯和從頭生物合成脂肪酸的主要部位。分解代謝長鏈脂肪酸和膽固醇生成的主要部位在肝組織。肌肉組織中主要發(fā)生的生物學(xué)過程是甘油三酯和脂肪酸的代謝。肌肉、脂肪與肝組織協(xié)同調(diào)控豬脂肪沉積與代謝過程，也影響整個機體的能量代謝與穩(wěn)態(tài)。

高通量測序技術(shù)為在整體水平研究特定細胞或組織中全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物提供了可靠的技術(shù)平臺。近年來，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)用于分析不同沉脂能力豬脂肪組織、肝和肌肉組織，鑒定其基因表達水平，篩選影響豬脂肪沉積和脂肪細胞分化的關(guān)鍵基因。本研究以前期研究的具有顯著差異脂肪沉積能力的松遼黑豬的脂肪組織、肝和肌肉組織的轉(zhuǎn)錄組高通量測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，系統(tǒng)分析不同分組和組織對基因表達的影響，以期鑒定影響豬脂肪沉積的關(guān)鍵基因及不同組織在脂肪沉積中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選擇體重100 kg左右健康且背膘厚差異顯著的6頭(高、低各3頭)松遼黑豬為試驗動物。高背膘厚組豬的背膘厚度((25.03±0.90) mm)顯著高于低背膘厚組((9.51±1.39) mm)。兩組在校正背膘厚度、胴體背膘厚度和板油重性狀上也差異極顯著。24 h禁食不禁水后，對試驗動物進行屠宰。采集背部皮下脂肪組織、肝和背最長肌組織樣品，立即放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序

按照Trizol Reagent (Invitrogen) 說明書提取3種組織的總RNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA)檢測RNA樣本的質(zhì)量。質(zhì)檢合格的RNA樣品用于構(gòu)建測序文庫。文庫質(zhì)檢合格后，在Illumina Hiseq 2000平臺上進行雙端轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)處理流程

使用Fastx-toolkit軟件(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit)對下機數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，除去接頭和低質(zhì)量的reads。使用TopHat v2.0.1軟件將高質(zhì)量的reads比對到豬參考基因組(Sscrofa 11.1, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-99/fasta/sus_scrofa/dna/)上。HT-seq軟件被用于鑒定基因在每個樣本中的表達水平。

1.4 差異表達基因鑒定

本研究采用R包DEseq2中雙因素的模塊進行差異表達基因(differentially expression genes, DEGs)的鑒定，分析不同沉脂能力和組織對基因表達的影響。采用的一般線性模型為 y=group+tissue+group*tissue，其中g(shù)roup為不同背膘厚度群體的效應(yīng)；tissue為組織的效應(yīng)；group*tissue為二者的交互作用。篩選DEGs的閾值為FDR<0.05和差異表達倍數(shù)大于2倍(Fold change>2或<0.5)。

1.5 DEGs的功能富集分析

為進一步分析DEGs的功能，使用在線分析工具DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)將篩選出的DEGs進行GO和KEGG功能富集分析。<0.05 通路和GO條目為DEGs顯著富集的通路。

1.6 實時熒光定量PCR驗證

選取6個差異表達基因，以豬的為內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR (RT-qPCR)驗證。根據(jù)NCBI上基因?qū)?yīng)的cDNA序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計引物(表1)，引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。提取3種組織樣品的總RNA，用RevertAid Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA，根據(jù) SYBRPrimix Ex Taq試劑盒說明書進行RT-qPCR。使用2法計算基因的相對表達量。

表1 RT-qPCR引物信息

2 結(jié) 果

2.1 測序數(shù)據(jù)整體分析

將測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控后，在脂肪組織、肝和背最長肌中分別獲得平均2.05×10、2.13×10和1.83×10條 reads，分別注釋到19 928、22 963和22 449個基因上。其中，14 830個基因在3個組織中共同表達。通過PCA、相關(guān)性和基因表達分析發(fā)現(xiàn)，相同組織樣本間的相關(guān)性較高，而不同組織間樣本的相關(guān)性較低(圖1)。

2.2 高低沉脂能力組豬差異表達基因篩選

將高背膘厚組和低背膘厚組樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行對比分析，以FDR< 0.05及|logFC|>1為篩選條件，共鑒定得到135個差異表達基因，其中在高背膘厚組中上調(diào)表達基因有59個，下調(diào)表達基因有76個(圖2)。

A.基因表達水平PCA圖；B.基因表達水平箱式圖。BHF、BLF、BHL、BLL、BHM和BLM分別代表高背膘厚組脂肪組織、低背膘厚組脂肪組織、高背膘厚組肝組織、低背膘厚組肝組織、高背膘厚組肌肉組織和低背膘厚組肌肉組織A. PCA diagram of gene expression; B. Box diagram of gene expression. BHF, BLF, BHL, BLL, BHM and BLM represents fat tissue in high backfat thickness pigs, fat tissue in low backfat thickness pigs, liver tissue in high backfat thickness pigs, liver tissue in low backfat thickness pigs, muscle tissue in high backfat thickness pigs, and muscle tissue in low backfat thickness pigs, respectively圖1 測序數(shù)據(jù)的整體分析Fig.1 Global analysis of sequencing data

圖2 不同脂肪沉積能力豬基因表達的火山圖Fig.2 Volcanic map of gene expression in pigs with different fat deposition capacities

KEGG通路功能富集分析結(jié)果表明，DEGs顯著富集在PPAR信號通路、MAPK信號通路、新陳代謝通路、脂肪酸代謝通路、甘油代謝通路等通路(表2)。進一步GO分析結(jié)果共發(fā)現(xiàn)28條顯著富集的GO條目(圖3)。

2.3 不同組織間差異表達基因篩選

以同樣的篩選標(biāo)準(zhǔn)(FDR< 0.05，|logFC|>1)，在脂肪與肝組織間、脂肪與肌肉組織間、肝與肌肉組織間分別鑒定得到10 894、10 088和8 898個差異表達基因。相對于肝和肌肉組織，脂肪組織中上調(diào)控表達的基因有4 101和5 705個，其中499個為共同高表達的基因。相對于脂肪和肌肉組織，肝組織中上調(diào)表達的基因分別有6 793和4 741個，其中2 925個基因是共同高表達基因；相對于肝和脂肪組織，肌肉中分別有4 157和4 383個基因是上調(diào)表達的，其中586個基因是共同高表達基因(圖4)。

圖3 高、低沉脂能力豬差異表達基因富集的GO條目Fig.3 GO terms enriched by differentially expressed genes in pigs with high and low fat deposition ability

表2 高、低沉脂能力豬差異表達基因富集通路

2.4 組織特異性高表達基因功能分析

將每個組織中特性高表達的基因進行KEGG通路分析，結(jié)果顯示，在脂肪組織中高表達的基因主要參與了脂肪調(diào)控通路、氧化磷酸化通路、MAPK信號通路、胰島素信號通路、三羧酸循環(huán)等通路；在臟組織中高表達的基因主要參與多種氨基酸和脂肪酸的代謝、膽汁分泌、PPAR信號通路等通路；在肌肉組織中，主要參與了蛋白質(zhì)的降解、PI3K-Akt信號通路、氧化磷酸化通路、Wnt信號通路、磷脂酰肌醇信號通路等(圖5)。這些基因及通路的功能與相應(yīng)組織在體內(nèi)發(fā)揮的作用一致。

2.5 RT-qPCR驗證

根據(jù)測序結(jié)果，挑選出6個DEGs進行RT-qPCR驗證。結(jié)果表明，6個基因的表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致(圖6)。這表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。

3 討 論

豬脂肪沉積性狀是一個受到多個組織共同調(diào)控的復(fù)雜性狀，其中脂肪組織、肝和肌肉組織是最重要的調(diào)控部位。近年來，基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)越來越多的應(yīng)用于挖掘與豬重要經(jīng)濟性狀相關(guān)的基因，但多數(shù)研究只針對一個組織進行研究。本研究系統(tǒng)分析了不同脂肪沉積能力豬的3個組織轉(zhuǎn)錄組，進而挖掘重要的功能基因。

A.肝與脂肪組織差異表達基因火山圖；B.肌肉與脂肪組織差異表達基因火山圖；C.肝與肌肉組織差異表達基因火山圖；D.不同組織間差異表達基因數(shù)目A. Volcanic map of differentially expressed genes between liver and adipose tissues; B. Volcanic map of differentially expressed genes between muscle and adipose tissues; C. Volcanic map of differentially expressed genes between liver and muscle tissues; D. Number of differentially expressed genes between different tissues圖4 不同組織的差異表達基因Fig.4 Differentially expressed genes in different tissues

圖5 不同組織上調(diào)表達基因顯著富集的通路Fig.5 Pathways of significant enrichment of up-regulation expressed genes among different tissues

圖6 差異表達基因的RT-qPCR驗證Fig.6 Verification of differentially expressed genes by RT-qPCR

脂肪沉積的多少由甘油三酯的生成、儲存、運輸和脂肪酸氧化的相對強度決定。針對不同的脂肪沉積能力，本研究在兩組中共發(fā)現(xiàn)135個差異表達基因，其中、1、、1、、、和超家族基因等在脂肪生產(chǎn)和代謝中發(fā)揮重要的作用。1、和基因是脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵基因。1基因參與了葡萄糖的代謝過程，為脂肪酸從頭合成提供了底物。同時，1基因在三羧酸循環(huán)過程中不僅為脂肪酸的合成提供了NADPH，還將乙酰輔酶A運輸出線粒體。SCD參與了超長鏈脂肪酸的合成和去飽和過程，是不飽和脂肪酸合成的限速酶。ACLY是乙酰輔酶A合成的關(guān)鍵酶。與本研究結(jié)果相一致，1、和基因在肥胖個體中上調(diào)表達。以上結(jié)果表明，高背膘厚組的豬脂肪酸從頭合成能力高于低背膘厚組。研究表明，1基因與甘油三酯的儲存和脂肪的生成密切相關(guān)。過表達1基因的小鼠增加了體內(nèi)膽固醇的含量和甘油三酯的積累。EHHADH能夠通過PPAR和AMPK信號通路參與脂肪酸代謝。PPAR信號通路是調(diào)控能量平衡、前脂肪細胞分化和增殖、脂肪代謝的關(guān)鍵通路。本研究發(fā)現(xiàn)，PPAR信號通路為顯著富集的通路。LEP是一種脂肪因子，在體內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)能量、脂肪和碳水化合物的代謝及調(diào)控內(nèi)分泌和免疫的功能。細胞色素450超家族基因21A2、2B22、27A1和8B1也差異表達，它們在超長鏈不飽和脂肪酸的代謝過程中起著重要作用。這表明，脂肪代謝在調(diào)控脂肪沉積過程中也發(fā)揮著重要的作用。

脂肪組織、肝和肌肉在豬脂肪生成和代謝過程中發(fā)揮著各自獨特的作用。本研究系統(tǒng)的比較了3個 組織中基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)了大量的差異表達基因。在脂肪組織中，高表達的基因顯著富集在脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵通路，如碳水化合物代謝、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化等通路。碳水化合物的代謝為脂肪酸的合成提供了底物；三羧酸循環(huán)將乙酰輔酶A從線粒體中轉(zhuǎn)運到脂肪細胞溶質(zhì)中，并為脂肪酸的合成提供NADPH；氧化磷酸化過程則為脂肪酸的生成提供了能量；胰島素信號通路對整個機體的胰島素敏感度和能量動態(tài)平衡起著至關(guān)重要的作用。這表明脂肪酸的從頭合成主要在脂肪組織。在肝組織中，上調(diào)表達基因主要參與了多種物質(zhì)的代謝過程，這與肝在體內(nèi)發(fā)揮的重要作用緊密相關(guān)。與前人的研究結(jié)果相符，豬肝并未參與脂肪的生成過程，只參與了脂肪酸的降解過程。同時，膽汁的生成與分泌通路也顯著富集。在肌肉中，高表達的基因參與了蛋白質(zhì)的降解、PI3K-Akt信號通路、氧化磷酸化通路、Wnt信號通路、磷脂酰肌醇信號通路等生物學(xué)過程。氧化膦酸化通路與肌肉內(nèi)的能量代謝相關(guān)；Wnt信號通路在調(diào)控胚胎和器官發(fā)育以及癌癥進展方面起著關(guān)鍵作用。不同組織在體內(nèi)發(fā)揮的作用大不相同，在不同組織中檢測到的差異表達基因數(shù)目大，得到的結(jié)果并未進行詳細的分析。但從組織中高表達基因富集的通路與其發(fā)現(xiàn)功能是相符的。這表明可以通過轉(zhuǎn)錄水平上基因的表達來鑒定不同組織的功能。

4 結(jié) 論

本研究系統(tǒng)分析了具有顯著差異脂肪沉積能力的松遼黑豬脂肪、肝和肌肉3個組織轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，不同組間差異表達基因結(jié)果提示，、1、、1、、、和超家族基因等是影響脂肪沉積的關(guān)鍵基因；不同組織間差異表達基因分析表明，脂肪組織是脂肪合成的主要部位，而肝和肌肉組織主要涉及脂肪酸的降解。本研究結(jié)果對豬脂肪性狀的遺傳改良、機理解析有一定參考意義。