趙 超，徐尚立，李 碩，穆繼安，李方博，張瑾麒，趙敏孟，劉 龍，龔道清，耿拓宇

(揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009)

家禽的外觀性狀如冠形、羽色、脛色等屬于質量性狀，易于觀測，是家禽品種的重要標志，在新品種(品系)培育過程中通常倍受關注。雞的脛色就是一種深受消費者、生產者和育種者關注的重要性狀，可分為主要受黑色素影響的深色脛和主要受葉黃素影響的淺色脛。由于雞脛部存在表皮層和真皮層兩種皮層，且各有不同色素的沉積，因此在肉眼觀察時，脛色實際上是兩種皮層色素產生的共同效果。

深色脛的形成主要是由黑色素沉積于脛部皮膚所致，因而黑色素合成的調控是關鍵。黑色素可分為真黑色素和褐黑色素。黑色素的合成起始于在酪氨酸酶(TYR)對L-酪氨酸的催化作用，產生的多巴經兩個不同的途徑分別生成真黑色素和褐黑色素，這取決于酪氨酸酶的活性，活性高時生成真黑色素，活性低時生成褐黑色素。以往的研究表明，深色脛的遺傳方式有兩種，即隱性伴性遺傳和常染色體顯性遺傳。關于深色脛的隱性伴性遺傳，早在二十世紀初，Bateson和Punnett就通過雜交試驗證明了雞的脛色性狀存在伴性遺傳方式，而1935年Knox提出，深色脛的抑制基因是顯性伴性基因，即黃脛個體攜帶顯性伴性基因，而深色脛個體攜帶隱性伴性基因。該顯性伴性抑制基因已被命名為真皮黑色素抑制基因，淺色脛的基因型為Z-，深色脛為Z-。后來的研究表明，該基因為不完全顯性伴性遺傳，深色脛的表型變化不僅與基因有關，而且與(Fibromelanosis, 常染色體顯性遺傳并作用于真皮層)有關，對有上位效應。深色脛的表型是由和兩個基因共同作用的結果。此外，Shinomiya等研究發(fā)現，突變對烏骨雞烏膚性狀的調控具有劑量效應。相對于真皮層的黑色素沉積由和基因控制，黑色素在表皮層的沉積則受到黑色素擴散基因(Extension)的調控，屬于常染色體顯性遺傳。來自基因連鎖分析等方面的研究證據，已將該基因位點定位于雞11號染色體上的黑素皮質激素受體1(melanocortin 1 receptor，1)基因。

MC1R擁有7個跨膜功能結構域(transmembrane domain,TM)，作為最小的G蛋白耦合受體，它的全長只有945 bp，無內含子，可編碼314個氨基酸，有超過60%的序列與哺乳動物同源。MC1R與其由垂體分泌的配體α-MSH結合，所形成的復合物可將無活性的二磷酸鳥苷(GDP)轉變?yōu)橛谢钚缘娜姿狲B苷(GTP)，以此激活膜上的腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)系統(tǒng)，并經Mg作用催化將ATP轉化為cAMP，后者激活酪氨酸酶，參與黑色素生成。遺傳學、生物化學和藥理學的證據均表明，來自MC1R的信號對TYR活性的調控是黑色素生成的重要因素。

由于黑羽也是黑色素沉積于羽毛所致，因此1基因不僅決定表皮層深色脛的形成，而且決定黑色羽毛的形成。2003年Kerje等通過雜交試驗推測1基因中錯義突變E92K和M71T是形成紅色原雞和白來航雞出現黑色羽毛的主要突變位點；Guo等通過對5個不同群體4種不同羽色雞的1基因進行生物信息學方法分析，發(fā)現c.274G>A促進真黑素沉積，而c.637T>C減少真黑素沉積；胡卓成等推測，在白絨烏骨雞1基因中的錯義突變H215P可能是抑制黑色素在羽毛沉積的原因；席蘇望等發(fā)現，在江西地方雞的1基因突變中，c.212T>C、c.274G>A和c.644A>C與黑色羽毛的形成相關聯(lián)。這些研究均支持1是影響表皮層黑色素沉積的重要基因。

本研究針對培育品系W系中的青脛性狀，通過正、反交雜交試驗，以明晰W系青脛性狀的遺傳規(guī)律，同時通過脛部皮膚的轉錄組測序篩查差異表達基因與富集通路，從而為W系青脛性狀的選擇提供指導，以及為闡明青脛性狀形成的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究為探明W品系培育過程中青脛性狀的遺傳規(guī)律，首先以培育品系中黑羽青脛成年公雞與洛島紅黃羽黃脛成年母雞為正交、黑羽青脛成年母雞與洛島紅黃羽黃脛成年公雞作為反交(公、母雞配比為1∶ 5)。在雜交試驗開始前配種母雞停止輸精3周，以確保正式輸精前所產蛋均為無精蛋。采用人工授精方式，收集種蛋兩批，2周一批，剔除畸形蛋、破損蛋后入孵，出雛時進行系譜記錄，記錄性別、脛色和羽色。在雌性雛雞中隨機選取青脛和黃脛雞各10只，處死后采集脛部皮膚樣，快速放于液氮中，并轉至-70 ℃冰箱中保存待用。本研究中的動物試驗方案符合動物福利與使用的相關準則，并獲得揚州大學動物福利與使用委員會的批準。

1.2 轉錄組測序

以青脛皮膚樣為處理組，黃脛皮膚樣為對照組(=4)。皮膚樣用干冰轉運至北京諾禾致源科技股份有限公司，并由該公司完成RNA-seq測序分析。測序分析的基本流程如下：使用Illumina 的NEBNextUltraRNA Library Prep Kit試劑盒建庫，在M-MuLV 逆轉錄酶體系和DNA polymerase I 體系下合成雙鏈cDNA，然后經過AMPure XP beads篩選后擴增和再純化，建立文庫，并基于Illumina測序平臺對文庫邊合成邊測序；接著對原始數據進行過濾(主要包括剔除帶接頭的reads、剔除含N(N表示無法確定堿基信息)的reads、剔除低質量的reads(Qphred ≤20的堿基數占整個read長度的50%以上的reads)；將過濾后得到的高質量序列經HISAT2 v2.0.5比對到參考基因組上；利用DESeq2 軟件(1.16.1)進行差異表達分析以及利用ClusterProfiler R 軟件實現差異表達基因的GO富集分析和KEGG分析等。差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)的篩選標準采用寬松(|log(Fold Change)|>0，adj<0.05)與嚴格(|log(Fold Change)|>1，adj<0.05)兩種標準。

1.3 熒光定量PCR分析

隨機選取8個差異表達基因，利用NCBI網站上在線工具Primer-BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計引物(表1)。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。RNA提取采用諾唯贊生物有限公司生產的RNA-easy Isolation Reagent (Vazyme #R701)試劑盒，cDNA合成采用HiScriptIII RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme#R323)試劑盒，使用Vazyme AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進行熒光定量PCR分析。具體操作按試劑盒說明書進行。熒光定量PCR采用10 μL體系，包括Mix 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，水3.6 μL；反應程序為95 ℃ 5 min，40個循環(huán)(95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s)。內參基因為。以2法計算各目的基因的相對表達量。

表1 熒光定量PCR引物的序列

1.4 統(tǒng)計分析

用EXCEL2016軟件整理數據，用IBM SPSS Statistics 26對青、黃脛的分離比例進行卡方檢驗，定量數據用檢驗統(tǒng)計分析，<0.05設定為統(tǒng)計顯著性的標準。

2 結 果

2.1 青脛性狀的遺傳規(guī)律分析

為探明W系中青脛性狀的遺傳規(guī)律，本研究利用W系中黑羽青脛成年公、母雞與洛島紅黃羽黃脛成年公、母雞進行正、反雜交。正交共獲得344只雛雞，其中公雞青、黃脛分別為172和20只，母雞青、黃脛分別為121和31只，合計正交后代中青脛293只，黃脛51只(表2)。反交共獲得329只雛雞，其中公雞青、黃脛分別為156和29只，母雞青、黃脛分別為100和44只，合計反交后代中青脛256只，黃脛73只(表2)。正、反雜交合計共獲得673只雛雞，其中公雞青、黃脛分別為328和49只，母雞青、黃脛分別為221和75只，合計青脛549只，黃脛124只(表3)。統(tǒng)計分析表明，無論是正交、反交還是所有雜交，后代中青脛個體的數量均顯著高于黃脛個體的數量，這提示青脛性狀相對于黃脛性狀為顯性。再者，無論是正交還是反交，后代公、母性別中均出現青、黃脛兩種表型，并不表現出伴性遺傳的現象，因此W系的青脛性狀是常染色體顯性遺傳。這里值得一提的是，根據脛色與羽色的記錄，結果發(fā)現黑羽與青脛完全關聯(lián)，黃羽與黃脛完全關聯(lián)，提示相對于黃羽黃脛表型，W系中的黑羽與青脛性狀可能受同一個基因所控制。

由于W系中的青脛性狀是常染色體顯性遺傳方式，因此可以不分性別地將正交和反交的后代按脛色類型合并。為探明本研究中青、黃脛性狀的控制基因數量，則將正交和反交后代中沒有脛色分離的雜交組合剔除，這樣在存在脛色分離的雜交組合后代中，共有238只雛雞，其中青脛雛雞121只，黃脛雛雞117只(表4)。根據卡方檢驗可知，青脛與黃脛的比值與分離比1∶1無顯著差異(=0.846)，提示青、黃脛性狀受一對等位基因控制。

表2 正交和反交后代的脛色統(tǒng)計

表3 所有雜交后代的脛色統(tǒng)計

表4 所有脛色分離雜交組合的后代脛色統(tǒng)計

2.2 轉錄組學分析

為探明青脛性狀形成的分子機制，本研究對雛雞青、黃脛皮膚的轉錄組進行了測序分析。測序數據顯示，兩組樣品的Raw reads平均值分別為43 754 542.5和45 229 562，過濾后Clean reads平均值分別為41 832 926.5和44 216 740，平均Q30值分別為93.90%和92.51%(表5)，達到下一階段分析的標準。在此基礎上，通過比較基因在青、黃脛皮膚中的表達值，按照寬松篩選標準共篩選到5 597個差異表達基因，其中相對于黃脛，青脛中有2 660個差異基因表達上調，2 937個表達下調(圖1)，而按照嚴格篩選標準共篩選到2 785個差異表達基因，其中相對于黃脛，青脛中有1 075個差異基因表達上調，1 710個表達下調(因篇幅所限，具體見OSID開放科學資料附表1)。在寬松篩選標準下，參與黑色素合成的差異表達基因列于表6中。值得注意的是，與黑色素合成有直接關系的幾個基因如1、、1在青脛皮膚中的表達量與

表5 測序數據的統(tǒng)計表

橫軸為log2 (Fold Change)，縱軸為-lg(Padj)。火山口的右側為上調的差異表達基因(DEG)，火山口的左側為下調的DEG。Padj表示校正后的P值The horizontal axis denotes log2 (fold change) and the vertical axis denotes -lg(Padj). The right side of the crater denotes the upregulated expression of the differentially expressed gene (DEG), and the left side of the crater denotes the downregulated expression of the DEGs. Padj represents the adjusted P value圖1 DEGs火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes

黃脛皮膚中的表達量存在極顯著差異。此外，在篩查到的差異表達基因中還發(fā)現一些以往報道尚未提及參與脛色形成的上游調控基因，如家族基因和家族基因，它們在青、黃脛皮膚中的表達量也存在顯著差異(adj <0.05,表6)。

利用差異表達基因進行GO和KEGG通路富集分析，按寬松篩選標準發(fā)現46條GO term和15個KEGG pathway顯著富集差異表達基因(因篇幅所限，具體見OSID開放科學資料附表2，附表3)，按嚴格篩選標準發(fā)現41條GO term和21個KEGG pathway顯著富集差異表達基因(因篇幅所限，具體見OSID開放科學資料附表4、附表5)。按寬松篩選標準篩選的顯著富集GO term中，有26條GO term注釋到生物學過程，10條注釋到細胞組分，10條注釋到分子功能。在這三大類別中分別選取富集程度最高的10個列于圖2，如生物學過程中的RNA加工(RNA processing)、細胞表面受體信號通路(cell surface receptor signaling pathway)、蛋白質磷酸化(protein phosphorylation)、多細胞生物發(fā)育(multicellular organism development)等，細胞組分中的細胞外基質(extracellular matrix)、多聚細胞骨架纖維(polymeric cytoskeletal fiber)、中間絲(intermediate filament)、中間絲細胞骨架(intermediate filament cytoskeleton)等，分子功能中的磷酸轉移酶活性(phosphotransferase activity)、醇基受體(alcohol group as acceptor)，蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、激酶活性(kinase activity)、蛋白酪氨酸激酶活性(protein tyrosine kinase activity)等?？傮w上，這些高度富集的GO term主要與細胞外基質與受體信號、信號傳導、細胞骨架與遷移有關。按寬松篩選標準篩選的顯著富集KEGG pathway中，富集程度最高的20條通路被列于圖3，包括Melanogenesis(黑色素生成)、Adherens junction(黏附連接)、Sphingolipid metabolism(鞘脂代謝)、Wnt signaling pathway(Wnt信號通路)、mTOR signaling pathway(mTOR信號通路)、MAPK signaling pathway (MAPK信號通路)、ErbB signaling pathway(ErbB信號通路)等。按嚴格篩選標準獲得的結果與上述類似?？傮w上，這些高度富集的KEGG pathway除了與黑色素生成通路有關外，還與細胞外基質與受體信號、信號傳導、細胞黏附、細胞骨架與遷移、鞘脂與糖脂代謝等通路有關。

表6 富集于黑色素生成通路上的差異表達基因

(轉下頁 Carried forward)

圖中橫坐標為GO Term，縱坐標為GO Term富集顯著性水平，用-lg(P adj)表示。從左往右，第1～10條、第11～20條和第21～30條分別為注釋到生物學過程(biological process，BP)、細胞組分(cell component，CC)和分子功能(molecular function，MF)上富集程度最高的GO term。Padj表示校正后的P值the horizontal axis denotes GO term, and the vertical axis denotes the enrichment significance level of GO term, which is represented by -lg(P adj). From left to right, columns 1-10, columns 11-20 and columns 21-30 show the highest enriched GO terms in the categories of biological process (BP), cell component (CC) and molecular function (MF), respectively. Padj represents the adjusted P value圖2 DEGs的GO富集分析柱狀圖Fig.2 The histogram for GO enrichment analysis of DEGs

圖中橫坐標為注釋到KEGG通路上的差異基因數與差異基因總數的比值，縱坐標為KEGG通路。圖中圓點的顏色代表差異表達基因在該通路上富集程度的統(tǒng)計顯著性，顏色由藍色向紅色變化表示統(tǒng)計上該通路的富集程度越高；而圓點的大小代表差異表達基因的數量，圓點越大表示該富集通路上的差異表達基因的數量越多The horizontal axis denotes the ratio of the number of the differentially expressed genes (DEGs) in the specified KEGG pathway to the total number of DEGs, and the vertical axis denotes the KEGG pathway. The colors of dots represent the statistical significance of the enrichment degree of DEGs in the specified pathway, and the change of color from blue to red indicates that the enrichment degree of the pathway become higher statistically. The sizes of the dots represent the number of DEGs. The larger the dot, the more DEGs in the KEGG pathway圖3 DEGs的KEGG通路富集分析散點圖Fig.3 Dotted plot for KEGG pathway enrichment analysis of DEGs

2.3 定量PCR對差異表達基因的驗證

隨機選取8個差異表達基因進行熒光定量PCR驗證。如圖4所示，相對于黃脛組，1r、、3、2和6基因在青脛皮膚中表達顯著升高，而5、4和1基因在青脛皮膚中表達降低，但4和1基因表達水平在青、黃脛組間的差異未達到統(tǒng)計上的顯著水平?？傮w而言，定量PCR的測定結果表明，轉錄組測序分析結果是可靠的。

脛部皮膚中各基因的相對表達量以黃脛組該基因表達量的倍數變化表示，n=6，*表示P<0.05，**表示P<0.01The relative expression of each gene is expressed as fold change over the expression of a given gene in yellow group, n=6, * denotes P<0.05, ** denotes P<0.01圖4 定量PCR對DEGs的驗證Fig.4 Validation of differentially expressed genes by quantitative PCR

3 討 論

脛色一直是雞育種中的一個重要外觀性狀，而青脛性狀則長期以來受到消費者的青睞。盡管有關青脛性狀的遺傳方式和控制基因的定位已取得很大的進展，但仍有一些問題有待深入研究加以解決，如：對青脛性狀控制基因的確定尚缺少充足的證據，控制基因通過何種機制參與青脛性狀的形成。本研究首先通過正反雜交明確了培育品系W系青脛性狀的遺傳方式為常染色體顯性遺傳方式，青、黃脛性狀受一對等位基因控制，并依據這些發(fā)現和前人的研究成果推測該控制基因為1基因。其次，本研究通過比較青、黃脛皮膚的轉錄組，發(fā)現1基因在青脛皮膚中的表達量遠高于黃脛皮膚中的表達量，進一步支持1基因是W系雞青脛性狀的控制基因。此外，通過轉錄組分析，不僅發(fā)現黑色素合成通路中的基因如、1參與青脛性狀的形成，而且還篩查到一些以往報道尚未提及的上游基因如和家族基因可能受1基因的影響而參與青脛性狀的形成，這為進一步闡明青脛性狀形成的分子機制奠定了良好的基礎。

以往的研究表明，青脛性狀存在常染色體顯性遺傳和隱性伴性遺傳。前者受位點(1基因)控制，而后者受基因控制。在本研究的正反雜交試驗中，青脛和黃脛兩種脛色均出現在正交和反交后代的同一性別中，且后代中青脛個體數遠多于黃脛個體數，這種脛色的遺傳方式均與受位點控制的常染色體顯性遺傳方式一致。Knox曾圍繞控制黑羽性狀的位點對脛色性狀的影響做過較為系統(tǒng)的研究，結果表明青脛性狀的遺傳屬于常染色體遺傳，且受位點上的基因控制。迄今為止，位點上共發(fā)現8個等位基因，依顯性程度排序為、、、、、、和，且對、為不完全顯性。田明和孫桂榮等的研究結果也表明，即使存在基因，基因型為EE的個體仍然是黑色脛，不過研究也發(fā)現位點非純合(E-)時，基因型為E-ZW的脛色表現為白色和黑色之間的中間色，這可能是深色表皮層和淺色真皮層共同產生的視覺效果。在本研究中，剔除后代沒有脛色分離的雜交組合(青脛親本的基因型為EE)，而對有分離的雜交組合(青脛親本的基因型為Ee)的后代進行脛色統(tǒng)計，可以發(fā)現青、黃脛的個體數之比與分離比1∶1非常接近，表明W系的青脛與洛島紅的黃脛可能受到位點上的一對等位基因控制。

以往的研究將1基因定位到控制雞羽色性狀的位點上，不過這種定位主要依賴于連鎖分析。本研究也發(fā)現雜交后代的羽色與脛色一同分離，即后代中只有黑脛黑羽和黃脛黃羽的個體，而沒有黑脛黃羽和黃脛黑羽的個體，這進一步說明W系中的黑脛性狀也受位點上的1基因控制。雖然關于1基因的序列突變與羽色變化的關聯(lián)分析研究較多，但關于該基因參與青脛性狀形成的機制研究卻較少。1作為一種定位于細胞膜上的受體，能夠與其配體α-MSH結合，可以激活一系列信號傳導分子如、，從而最終作用于、1等基因，影響黑色素的合成。的確，轉錄組分析不僅發(fā)現1在青、黃脛皮膚中的表達差異，也發(fā)現、的家族基因及、1基因在青、黃脛皮膚中的表達存在明顯差異，這些結果均支持W系的青脛性狀受1控制的觀點。再者，差異表達基因的GO term和KEGG pathway富集分析均表明青脛的形成涉及細胞外基質與受體信號、信號傳導、細胞骨架與遷移、細胞黏附、鞘脂與糖脂代謝。1和其配體α-MSH的結合就涉及細胞外基質與受體信號、信號傳導，而黑色素的合成與轉運則涉及黑色素細胞和黑素小體的遷移，因此和細胞骨架與遷移有關。綜上所述，1及其所在通路上的基因參與并控制W系中青脛性狀的形成。

在本研究中，青、黃脛皮膚的轉錄組分析還揭示了一些在以往報道中尚未提及參與脛色形成的基因如16、3、10。這些基因主要在本研究所揭示的信號通路(Wingless/Integrated Signaling Pathway)上。以往研究表明，該通路上某些基因的突變與黑色素瘤的發(fā)生密切關系。還有研究發(fā)現，當神經嵴細胞缺失1或3基因時，這些細胞就不能分化為黑素細胞，而當恢復3基因后，基因的表達得以維持，這些細胞又開始分化為黑素細胞。因此，信號通路也參與黑色素的合成，與本研究轉錄組分析時青、黃脛間差異表達基因顯著富集的信號通路一致。至于1的信號通路如何影響信號通路上的基因表達，仍有待深入研究。

4 結 論

本研究明確了培育品系W系的青脛性狀為常染色體顯性遺傳，為該性狀受1基因控制提供了有力證據，并發(fā)現了一些以往報道尚未提及參與青脛性狀形成的基因與通路。這些發(fā)現將有助于雞品種(系)培育過程中青脛性狀的選擇與青脛性狀形成的分子機制的闡明。