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山羊RORα基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及功能分析

2022-07-07 08:23高登科趙泓淙靳亞平陳華濤
畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2022年6期
關(guān)鍵詞:質(zhì)粒引物生物鐘

高登科,趙泓淙,董 浩,靳亞平,陳華濤*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,楊凌 712100; 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,楊凌 712100)

千百萬(wàn)年來(lái)地球圍繞地軸自轉(zhuǎn),形成了周期性的明/暗循環(huán),賦予了地球表面光照時(shí)間、溫度和能量等外部環(huán)境的晝夜節(jié)律性變化。這些節(jié)律性變化使地球上的生物在進(jìn)化壓力的長(zhǎng)期驅(qū)動(dòng)下產(chǎn)生了與之相適應(yīng)的內(nèi)在計(jì)時(shí)機(jī)制,從而導(dǎo)致機(jī)體大多數(shù)生理功能具有了以近似24 h為周期的節(jié)律性振蕩,被稱為晝夜節(jié)律。生物體用以預(yù)測(cè)時(shí)間變化和調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的內(nèi)源性計(jì)時(shí)機(jī)制則被稱為生物鐘。作為一種重要的調(diào)控系統(tǒng),生物鐘與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育等生理功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)密切相關(guān)。當(dāng)生物鐘受到環(huán)境、基因突變等因素干擾時(shí),機(jī)體的生理過(guò)程也會(huì)發(fā)生紊亂,從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。哺乳動(dòng)物的生物鐘系統(tǒng)由位于下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)的中樞生物鐘和分布于機(jī)體幾乎所有細(xì)胞、組織與器官的外周生物鐘組成。SCN通過(guò)接收和整合來(lái)自視網(wǎng)膜下丘腦束傳來(lái)的光信號(hào)來(lái)調(diào)控機(jī)體中樞生物鐘的運(yùn)轉(zhuǎn),并通過(guò)神經(jīng)和體液途徑將信號(hào)信息傳遞給大腦其他部位以及外周組織,驅(qū)動(dòng)外周生物鐘的節(jié)律性振蕩,從而使機(jī)體維持生理穩(wěn)態(tài)。

哺乳動(dòng)物生物鐘調(diào)控機(jī)制雖然具有一定的物種差異性,但在分子水平上其主要依賴于1、、(1、2、3)、(1、2)和(α、β)等核心生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,幾乎所有的細(xì)胞都表達(dá)這些生物鐘基因,并具有產(chǎn)生晝夜節(jié)律性振蕩的潛能,不同物種的核心生物鐘調(diào)控機(jī)制在進(jìn)化上具有高度保守性。維甲酸相關(guān)孤兒受體α(retinoic acid-related orphan receptors alpha,RORα)作為生物鐘系統(tǒng)的重要組成部分,在維持生物鐘的正常運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在生物鐘的轉(zhuǎn)錄反饋環(huán)路中,RORα通過(guò)與1基因啟動(dòng)子上特定的DNA反應(yīng)元件即維甲酸相關(guān)孤兒受體反應(yīng)元件(RORE:由一段(G/A)GGTCA核心序列和一段6 bp富含A/T的前導(dǎo)序列構(gòu)成)結(jié)合來(lái)激活基因轉(zhuǎn)錄。同時(shí),REV-ERBs作為轉(zhuǎn)錄抑制因子,通過(guò)與RORα競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RORE元件來(lái)抑制1的轉(zhuǎn)錄。此外,α自身的轉(zhuǎn)錄也受到一些上游因子的調(diào)節(jié),如DBP/NFIL3會(huì)與α基因啟動(dòng)子上的D-box元件結(jié)合來(lái)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。反過(guò)來(lái),和3的轉(zhuǎn)錄也分別受到BMAL1/CLOCK和RORα的調(diào)控。總之,α與1和等核心生物鐘基因一起形成了多個(gè)轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)路,共同維持著生物鐘系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。除此之外,有研究發(fā)現(xiàn)RORα作為脂質(zhì)和脂蛋白代謝、脂肪生成和血管炎癥的重要調(diào)節(jié)因子,在機(jī)體脂代謝和炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究表明,RORα還在細(xì)胞凋亡以及腫瘤發(fā)生過(guò)程中扮演著重要角色。

然而,上述文獻(xiàn)證據(jù)大多是基于模式動(dòng)物小鼠來(lái)研究的,RORα蛋白的功能是否具有種屬特異性尚不清楚。山羊作為人類最早馴化的家畜之一,在人類農(nóng)業(yè)文明和經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮重要作用,一直是畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。有研究報(bào)道,絨山羊的產(chǎn)絨性能受到晝夜節(jié)律生物鐘的影響。然而,山羊生物鐘系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍未被完全解析。作為生物鐘系統(tǒng)的重要組成部分,α基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)(coding sequence,CDS)還未被克隆和深入研究。基于此,本研究旨在克隆山羊生物鐘基因α的編碼區(qū)CDS片段并構(gòu)建其真核表達(dá)載體,進(jìn)一步對(duì)山羊α基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能的初步研究,為后續(xù)探究RORα蛋白生物學(xué)功能及其在山羊生物鐘系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、主要試劑及儀器

山羊肝組織取自1只12月齡健康的雄性西農(nóng)薩能奶山羊;HEK293T細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);TRIzol、PrimeSTARMax DNA Polymerase、Quick CutR I、Quick CutI、Quick CutI購(gòu)自日本TaKaRa公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自AG生物工程有限公司;THUNDERBIRD SYBRqPCR Mix購(gòu)自日本ToYoBo公司;ClonExpressII One Step Cloning Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DH5α感受態(tài)細(xì)胞、膠回收試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司;TurboFect Transfection Reagent購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)于Promega公司;BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;脫脂奶粉購(gòu)于美國(guó)BD公司;HRP標(biāo)記的鼠抗β-actin抗體購(gòu)自中國(guó)三箭公司;兔抗HA抗體購(gòu)自Abcam公司;HRP共軛山羊抗兔抗體購(gòu)自中國(guó)中杉金橋公司;ECL HRP底物試劑盒購(gòu)自北京迪寧生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)室具有PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、熒光定量系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、凝膠成像分析系統(tǒng)(英國(guó)Syngene公司);核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)和CO培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)等儀器設(shè)備。

1.2 山羊肝組織cDNA的獲取及引物設(shè)計(jì)

稱取20 mg山羊肝組織,使用TRIzol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中山羊α基因(NM_001285652.1)的CDS區(qū),使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物。同時(shí)在引物上下游的5′端添加與pcDNA3.1-Puro-N-3HA載體R I 酶切位點(diǎn)處互補(bǔ)配對(duì)的同源序列,設(shè)計(jì)帶有同源臂的引物。另外,根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中山羊1基因啟動(dòng)子(1-Promoter)序列(NC_030822.1)與1D1啟動(dòng)子(1D1-Promoter)序列(NC_030826.1)(兩個(gè)基因的啟動(dòng)子序列均含有RORE元件),使用Primer Premier 6.0軟件分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增山羊1-Promoter區(qū)域和1D1-Promoter區(qū)域的引物。前者在引物上下游5′端添加與pGL4.10載體I酶切位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)的同源序列,后者在引物上下游5′端添加與pGL4.10載體I酶切位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)的同源序列,設(shè)計(jì)帶有同源臂的引物。引物序列信息見(jiàn)表1,所有引物均交由西安擎科生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行合成。

表1 引物序列信息

下劃線部分為酶切位點(diǎn)

The underlined parts are the sequences of the added restriction enzyme sites

1.3 pcDNA3.1-3HA-gRORα真核表達(dá)載體的構(gòu)建

1.3.1 山羊α基因CDS區(qū)的克隆 以山羊的cDNA為模板擴(kuò)增帶有同源臂的α基因的CDS區(qū)片段。PCR反應(yīng)程序如下:在反應(yīng)離心管中加入cDNA模板4 μL(50 ng · μL),上、下游引物各1 μL(10 μmol·L),2×PrimeSTAR Max Premix 25 μL,ddHO 19 μL,建立50 μL的PCR反應(yīng)體系;PCR程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃ 變性10 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸105 s,循環(huán)35次;72 ℃ 總延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,對(duì)符合預(yù)期的條帶按照DNA純化回收試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行純化回收。

1.3.2 pcDNA3.1-3HA-gRORα載體的構(gòu)建及鑒定 使用限制性內(nèi)切酶R I將pcDNA3.1-Puro-N-3HA載體進(jìn)行酶切線性化處理,并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)檢測(cè)酶切產(chǎn)物,將符合預(yù)期的條帶使用膠回收試劑盒回收純化。根據(jù)ClonExpress快速重組克隆試劑盒說(shuō)明書(shū),將膠回收得到的帶有同源臂的目的基因片段與酶切線性化的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Puro-N-3HA進(jìn)行重組連接,重組反應(yīng)體系:線性化載體1.5 μL,片段3.5 μL,Exnase Ⅱ 2 μL, 5×CE Ⅱ Buffer 4 μL,加水至20 μL。將反應(yīng)混合液在37 ℃條件下反應(yīng)15 min以完成重組反應(yīng),得到重組產(chǎn)物。將重組產(chǎn)物按照轉(zhuǎn)化反應(yīng)操作說(shuō)明轉(zhuǎn)至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,之后涂布于含氨芐霉素30 μg · mL的固體培養(yǎng)基中。12 h后挑取單克隆菌落,于37 ℃搖床培養(yǎng)12 h,使用無(wú)內(nèi)毒素小提中量試劑盒提取質(zhì)粒并測(cè)定濃度。隨后使用限制性內(nèi)切酶R I對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切鑒定。同時(shí)以重組質(zhì)粒為模板,使用α基因的引物進(jìn)行PCR鑒定。將酶切與PCR鑒定結(jié)果符合預(yù)期的重組質(zhì)粒送至西安擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。返回序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì),將比對(duì)正確的質(zhì)粒樣本命名為pcDNA3.1-3HA-gRORα真核表達(dá)載體。

1.3.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞 復(fù)蘇HEK293T細(xì)胞并進(jìn)行傳代,以每孔4×10個(gè)細(xì)胞接種至1個(gè)6孔板,以每皿8×10個(gè)細(xì)胞接種至6個(gè)60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿。待HEK293T細(xì)胞密度達(dá)到60%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將pcDNA3.1-3HA-gRORα作為試驗(yàn)組,pcDNA3.1-Puro-N-3HA作為對(duì)照組。將兩組質(zhì)粒按照TurboFect轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)的操作步驟分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。6孔板中,試驗(yàn)組質(zhì)粒和對(duì)照組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染3孔,轉(zhuǎn)染后24 h收樣,用于檢測(cè)山羊α基因在mRNA水平的表達(dá)。6個(gè)60 mm 皿中,試驗(yàn)組質(zhì)粒和對(duì)照組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染3皿,轉(zhuǎn)染48 h后收樣,用于檢測(cè)山羊α基因在蛋白水平的表達(dá)。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)山羊α基因在mRNA水平的表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h后,使用TRIzol試劑提取細(xì)胞樣品總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并稀釋至5 ng·μL,作為模板備用。用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)人與山羊通用的α引物序列以及人的引物序列(表1)。使用ToYoBo的THUNDERBIRD SYBRqPCR Mix并按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)反應(yīng)。反應(yīng)體系:cDNA 5 μL,qPCR Mix 10 μL,上、下游引物各 1 μL,去離子水3 μL。qPCR反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min; 95 ℃ 10 s;60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,95.5 ℃ 5 s。使用熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng),以人的基因作為內(nèi)參基因,并采用2的相對(duì)定量法對(duì)樣本進(jìn)行定量分析。

1.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)山羊α基因在蛋白水平的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后,提取細(xì)胞蛋白樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting,WB)試驗(yàn)。具體操作:將細(xì)胞收集至離心管中,按照RIPA裂解液操作說(shuō)明處理細(xì)胞得到蛋白樣品。使用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白濃度后加入Loading Buffer,100 ℃水浴10 min后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上;使用10%的脫脂奶粉封閉2 h。封閉完成后,TBST溶液中洗膜4次,每次5 min。將PVDF膜置于兔抗HA抗體工作液(1∶2 000稀釋)中,室溫?fù)u床孵育2 h;TBST洗膜4次,每次5 min。之后將PVDF膜置于HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液(1∶5 000 稀釋)中,室溫?fù)u床孵育2 h;TBST洗膜4次,每次5 min。 稍晾干后,將膜置于3 mL ECL發(fā)光液中作用2 min,于暗室中曝光并保存目標(biāo)蛋白結(jié)果圖。將曝光后的膜取出,TBST洗膜2次,每次5 min。加入適量抗體洗脫液,室溫孵育15 min,棄去洗脫液,TBST洗膜3次,每次5 min。隨后再次進(jìn)行封閉,操作與上述相同。封閉完成后,將PVDF膜置于HRP標(biāo)記的β-actin抗體工作液(1∶5 000稀釋)中,室溫?fù)u床孵育2 h;TBST洗膜4次,每次5 min。之后將膜放入ECL發(fā)光液中作用2 min,于暗室中曝光并保存目標(biāo)蛋白結(jié)果圖。最后使用ImageJ軟件對(duì)轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組的蛋白條帶分別進(jìn)行灰度分析,并與β-actin蛋白進(jìn)行均一化處理。

1.4 山羊RORα基因生物信息學(xué)分析

利用Ensembl在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ensembl.org/index.html)對(duì)山羊α基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找山羊和小鼠、大鼠、人、牛、綿羊、豬、馬、斑馬魚(yú)等多個(gè)物種的α基因CDS序列(表2)。使用生物信息學(xué)軟件DNAStar對(duì)各物種α基因的CDS序列進(jìn)行同源性比對(duì);應(yīng)用MEGA7軟件對(duì)各物種α基因的CDS序列進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù);使用在線軟件 SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk /services/ TMHMM/)、ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、ProtScale(https://web.expasy.org/ protscale/)、SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對(duì)山羊RORα蛋白的理化性質(zhì)、親/疏水性、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白二級(jí)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析。最后,使用pyMOL軟件對(duì)山羊、小鼠和人三者的RORα蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行相似性比較。

1.5 pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc與pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建

使用基因組DNA提取試劑盒提取山羊肝組織的基因組DNA。以基因組DNA為模板,利用設(shè)計(jì)好的帶有同源臂的引物(表1)分別擴(kuò)增山羊1-Promoter片段以及1D1-Promoter片段,擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行凝膠電泳鑒定,目的條帶按照膠回收試劑盒操作說(shuō)明分別進(jìn)行膠回收。將膠回收產(chǎn)物分別與I或I線性化的pGL4.10載體進(jìn)行同源重組連接,操作步驟同“1.3.2”。隨后分別使用限制性核酸內(nèi)切酶I和I對(duì)連接有1-Promoter片段及連接有1D1-Promoter片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切鑒定。同時(shí)以重組質(zhì)粒為模板,使用1-Promoter和1D1-Promoter的擴(kuò)增引物對(duì)相應(yīng)的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。將酶切及PCR鑒定結(jié)果符合預(yù)期的重組質(zhì)粒送至西安擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定,返回序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì)。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為pGL4.10-BMAL1-Promoter-和pGL4.10-NR1D1-Promoter-。

表2 各物種RORα基因CDS區(qū)序列來(lái)源

1.6 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)

將HEK293T細(xì)胞以每孔5×10個(gè)細(xì)胞接種至1個(gè)24孔板中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后,使用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1-3HA-gRORα真核表達(dá)載體(試驗(yàn)組)、pcDNA3.1-Puro-N-3HA空載體(對(duì)照組)分別與pRL-CMV海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(內(nèi)參質(zhì)粒)和pGL4.10-BMAL1-Promoter-(或pGL4.10-NR1D1-Promoter-)螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中,每組平行設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。轉(zhuǎn)染36 h后,按照雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明收集并處理細(xì)胞樣品,使用BioTek Synergy 2多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值,計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度,測(cè)定重復(fù)3次取平均值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,兩組間樣本均數(shù)比較采取檢驗(yàn),*<0.05表示差異顯著,**<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 山羊RORα基因的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建

對(duì)山羊α基因CDS區(qū)全長(zhǎng)序列分析后發(fā)現(xiàn),山羊α基因共包含10個(gè)外顯子,各個(gè)外顯子長(zhǎng)度在28 ~ 396 bp之間,所有內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)序列均符合GT-AG法則(表3)。隨后,提取了山羊肝組織的總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板使用PCR技術(shù)成功擴(kuò)增獲得山羊α基因CDS區(qū)片段,電泳結(jié)果如圖1A所示,在1 500 bp下方觀察到單一條帶,與預(yù)期結(jié)果一致(1 407 bp)。將擴(kuò)增片段進(jìn)行純化回收后,與R I酶切線性化的骨架載體pcDNA3.1-Puro-N-3HA進(jìn)行同源重組連接,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-3HA-gRORα。通過(guò)酶切和PCR鑒定重組載體,同時(shí)用R I對(duì)空載體進(jìn)行單酶切作對(duì)照,鑒定結(jié)果如圖1B所示。重組載體經(jīng)過(guò)R I酶切后獲得兩條目的條帶,上方條帶大小與空載體單酶切條帶一致(5 211 bp), 下方條帶大小與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小一致(1 407 bp)。最后將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果顯示pcDNA3.1-3HA-gRORα中插入片段的序列與NCBI庫(kù)中山羊α基因已知序列完全一致。以上結(jié)果表明成功獲得了山羊α基因CDS區(qū)全長(zhǎng)片段,且真核表達(dá)載體pcDNA3.1-3HA-gRORα構(gòu)建成功。

2.2 qPCR和WB檢測(cè)山羊RORα基因在mRNA及蛋白水平的過(guò)表達(dá)效果

qPCR結(jié)果如圖2A所示,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組α基因的mRNA表達(dá)量升高約500倍(<0.01)。WB結(jié)果如圖2B所示,用HA抗體孵育后,試驗(yàn)組在56 ku處有明顯的條帶,而對(duì)照組在相應(yīng)位置無(wú)條帶。上述結(jié)果表明,pcDNA3.1-3HA-gRORα轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后山羊α基因在mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組。

2.3 山羊RORα基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1 同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 使用DNAStar軟件對(duì)多個(gè)物種α基因CDS區(qū)進(jìn)行相似性分析,結(jié)果如圖3所示。山羊α CDS區(qū)與小鼠、人、大鼠、牛、綿羊、馬、豬和斑馬魚(yú)的α CDS區(qū)相似性分別為:89.2%、94.1%、89.5%、97.1%、97.5%、94.0%、95.2%、70.7%。不同物種間基因相似性較高,進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性。使用MEGA6軟件構(gòu)建α基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果如圖4所示,山羊與綿羊的親緣關(guān)系最近,其次是和牛、豬等其它哺乳動(dòng)物,和斑馬魚(yú)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到RORB、RORC、NRIP1(nuclear receptor interacting protein 1)、SLC1A6(solute carrier family 1 member 6)、KAT5(lysine acetyltransferase 5)、GRM1(glutamate metabotropic receptor 1)、TRPC3(transient receptor potential cation channel subfamily C member 3)、ITPR1(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1)、ATP2A2(ATPase sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Catransporting 2)、ATP2A3(ATPase sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Catransporting 3)共10個(gè)蛋白可能和RORα蛋白存在相互作用(圖5)。

表3 山羊RORα基因的剪接位點(diǎn)

A. RORα基因CDS區(qū)擴(kuò)增結(jié)果:M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. RORα基因CDS區(qū)片段。B. pcDNA3.1-3HA-gRORα重組載體酶切鑒定結(jié)果:M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 空載體單酶切產(chǎn)物;2. 重組載體pcDNA3.1-3HA-gRORα單酶切產(chǎn)物;3. RORα基因質(zhì)粒PCR目的條帶A. Amplification result of RORα gene CDS region: M. 5 000 bp DNA Marker; 1. The fragment of RORα gene CDS region. B. Restriction digestion result of pcDNA3.1-3HA-gRORα eukaryotic expression vector: M. 15 000 bp DNA Marker; 1. Single digested product of empty vector; 2. Single digestion product of recombinant vector pcDNA3.1-3HA-gRORα; 3. The PCR target band of RORα gene圖1 山羊RORα基因CDS擴(kuò)增與pcDNA3.1-3HA-gRORα真核表達(dá)載體鑒定結(jié)果Fig.1 Results of goat RORα gene CDS amplification and identification of pcDNA3.1-3HA-gRORα eukaryotic expression vector

A.山羊RORα基因mRNA水平相對(duì)表達(dá)量;B. RORα蛋白WB鑒定結(jié)果。**表示差異極顯著(P<0.01)A. Relative mRNA expression of goat RORα gene; B. WB analysis of goat RORα protein expression. ** indicating that the difference is extremely significant (P< 0.01)圖2 qPCR及WB檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of qPCR and WB analysis

圖3 RORα基因CDS區(qū)序列同源性比對(duì)Fig.3 Sequence homology alignment of RORα gene CDS region

2.3.2 山羊RORα蛋白理化性質(zhì)分析 利用在線工具ExPASy中的ProtParam對(duì)山羊RORα蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析,結(jié)果顯示山羊RORα蛋白理論分子質(zhì)量為53 397.15,分子式為CHNOS,原子總數(shù)是7 430個(gè),等電點(diǎn)(pI)為6.37,屬于堿性蛋白;該蛋白含有468個(gè)氨基酸,其中亮氨酸含量最高(8.3%),色氨酸含量最低(0.6%)(表4);在水中以280 nm預(yù)測(cè)消光系數(shù)是41 590;半衰期為30 h;不穩(wěn)定系數(shù)為38.97;脂肪族系數(shù)為78.16。

2.3.3 親/疏水性預(yù)測(cè) 利用在線工具ExPASy對(duì)山羊RORα蛋白氨基酸序列的親水/疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果如圖6所示,山羊RORα蛋白氨基酸序列最低分值為-3.578(位于第115、116位氨基酸),親水性最強(qiáng);最高分值為2.744(位于第369位氨基酸),疏水性最強(qiáng)。綜合來(lái)看,該蛋白整條肽鏈大部分屬于親水區(qū)域,由此推測(cè)山羊RORα蛋白為親水性蛋白。

2.3.4 信號(hào)肽及跨膜區(qū)預(yù)測(cè) 利用在線工具SignalP-5.0對(duì)山羊RORα氨基酸進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,該蛋白有12%的概率存在位于0~18氨基酸之間的信號(hào)肽,該蛋白有信號(hào)肽的概率較小。利用在線軟件TMHMM Serverv.2.0對(duì)山羊RORα蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,該蛋白不存在跨膜區(qū)。

2.3.5 山羊RORα蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用在線工具SOPMA對(duì)山羊RORα蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果如圖7所示,山羊RORα蛋白主要由α-螺 旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲等組成,其中α-螺旋占43.8%,延伸鏈占10.04%,β-轉(zhuǎn)角占4.91%,無(wú)規(guī)則卷曲占41.24%。

圖4 RORα基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of RORα gene

圖5 RORα互作蛋白預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of proteins interacting with RORα protein

表4 山羊RORα蛋白氨基酸組成

圖6 山羊RORα蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)Fig.6 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of goat RORα protein

h表示α-螺旋,e表示延伸鏈,t表示β-轉(zhuǎn)角,c表示無(wú)規(guī)則卷曲h stands for alpha helix, e stands for extended strand, t stands for beta turn, c stands for random coil圖7 山羊RORα蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.7 Analysis of the goat RORα protein secondary structure

2.3.6 山羊RORα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 通過(guò)在線軟件SWISS-MODEL對(duì)山羊(圖8A)、小鼠(圖8B)和人(圖8C)的RORα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,3個(gè)物種的RORα蛋白均具有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲等復(fù)雜結(jié)構(gòu)。使用pyMOL軟件對(duì)3個(gè)物種的蛋白模型的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示山羊和小鼠模型的原子位置均方根偏差(root-mean-square deviation,RMSD)為0.068,山羊和人的RMSD為0.077,山羊RORα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型與小鼠和人的差異均極小。

2.4 pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc及pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc載體的鑒定

以山羊肝基因組DNA為模板,利用合成的1-Promoter及1D1-Promoter引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖9A、9C所示,1-Promoter(862 bp)及1D1-Promoter(1 657 bp)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一,與目的片段大小一致,無(wú)非特異性條帶。將克隆得到的目的條帶分別與pGL4.10空載體進(jìn)行重組連接,構(gòu)建pGL4.10-BMAL1-Pro-moter-和pGL4.10-NR1D1-Promoter-重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR及酶切鑒定,結(jié)果顯示pGL4.10-BMAL1-Promoter-報(bào)告質(zhì)粒經(jīng)I單酶切后得到862 和4 242 bp兩個(gè)片段(圖9B),且以pGL4.10-BMAL1-Promoter-為模板PCR擴(kuò)增出大小約862 bp的片段。pGL4.10-NR1D1-Promoter-報(bào)告質(zhì)粒經(jīng)I單酶切后得到1 657和4 242 bp兩個(gè)片段(圖9D),且以pGL4.10- NR1D1-Promoter-為模板PCR擴(kuò)增出大小約1 657 bp 的片段。同時(shí),兩個(gè)重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果也均與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列完全一致。上述結(jié)果表明,含有山羊1基因啟動(dòng)子片段的pGL4.10-BMAL1-Promoter-重組質(zhì)粒和含有山羊1D1基因啟動(dòng)子片段的pGL4.10-NR1D1-Promoter-重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A.山羊RORα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);B.小鼠RORα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);C.人RORα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)A. Prediction of goat RORα protein tertiary structure; B. Prediction of mouse RORα protein tertiary structure; C. Prediction of human RORα protein tertiary structure圖8 山羊、小鼠和人RORα蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of the tertiary structure of RORα protein in goat, mouse and human

2.5 山羊RORα蛋白成功上調(diào)山羊BMAL1和NR1D1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性

使用pcDNA3.1-3HA-gRORα質(zhì)粒及含有RORE元件的pGL4.10-BMAL1-Promoter-和pGL4.10-NR1D1-Promoter-重組質(zhì)粒分別進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)以探究山羊RORα蛋白的功能。如圖10A所示,本研究中擴(kuò)增獲得的1-Promoter片段位于山羊1基因的-684 ~ +178位置(山羊1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為+1),包含3個(gè)RORE元件;擴(kuò)增獲得的1D1-Promoter位于山羊1D1基因的-1 421~+236位置(山羊1D1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為+1), 也包含3個(gè)RORE元件。雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)結(jié)果表明,與共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Puro-N-3HA空質(zhì)粒的對(duì)照組相比,共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-3HA-gRORα質(zhì)粒時(shí)1-Promoter(圖10B)和1D1-Promoter(圖10C)調(diào)控下的熒光素酶活性均極顯著升高(<0.01)。上述結(jié)果表明,山羊RORα蛋白可以顯著上調(diào)山羊生物鐘基因1和1D1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,這與小鼠等哺乳動(dòng)物生物鐘轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制相符。

3 討 論

晝夜節(jié)律是地球上的生命體對(duì)地球自轉(zhuǎn)產(chǎn)生的晝夜更替現(xiàn)象所做出的主動(dòng)適應(yīng)性變化。多項(xiàng)研究表明,晝夜節(jié)律紊亂與睡眠障礙、代謝失調(diào)、腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。生物體內(nèi)參與生物鐘發(fā)生和維持的基因被稱為生物鐘基因,這些基因與鐘控基因共同調(diào)控哺乳動(dòng)物生理、生化、行為等方面的晝夜節(jié)律性變化。RORα作為生物鐘系統(tǒng)的重要組分,在維持生物鐘的正常運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而,目前有關(guān)生物鐘分子調(diào)控機(jī)制的研究大多是以小鼠為模型,關(guān)于山羊生物鐘基因及山羊生物鐘轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制方面的研究相對(duì)較少。本課題組前期成功構(gòu)建了山羊生物鐘基因1、和1D1的真核表達(dá)載體,發(fā)現(xiàn)1與1D1基因mRNA節(jié)律性表達(dá)于山羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞中,并證明了1基因通過(guò)調(diào)節(jié)山羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞中類固醇合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控睪酮產(chǎn)生。趙艷紅等前期雖已克隆了內(nèi)蒙古絨山羊α基因的CDS區(qū),但只是部分序列(417 bp),目前尚未有克隆山羊α基因全長(zhǎng)CDS序列(1 407 bp)的研究報(bào)道?;诖?,本研究克隆了山羊α基因CDS區(qū)全長(zhǎng)片段,構(gòu)建了其真核表達(dá)載體,并對(duì)山羊RORα進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,初步探究了其在山羊生物鐘系統(tǒng)中的作用機(jī)制,為后續(xù)進(jìn)一步深入解析山羊生物鐘系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

A. BMAL1-Promoter PCR擴(kuò)增結(jié)果:M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. BMAL1-Promoter目的片段。B. pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc載體酶切及PCR鑒定結(jié)果:M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 空載體單酶切產(chǎn)物;2. pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc載體單酶切產(chǎn)物;3. BMAL1-Promoter質(zhì)粒PCR目的條帶。C. NR1D1-Promoter PCR擴(kuò)增結(jié)果:M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.NR1D1-Promoter目的片段。D. pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc載體酶切及PCR鑒定結(jié)果:M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 空載體單酶切產(chǎn)物;2. pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc載體單酶切產(chǎn)物;3. NR1D1-Promoter質(zhì)粒PCR目的條帶A. PCR amplification result of BMAL1-Promoter: M. 5 000 bp DNA Marker; 1. The target band of BMAL1-Promoter.B. Restriction digestion and PCR result of pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc vector: M. 5 000 bp DNA Marker; 1. Single digested product of empty vector; 2. Single digestion product of pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc vector; 3. The target band of BMAL1-Promoter. C. PCR amplification result of NR1D1-Promoter: M. 5 000 bp DNA Marker; 1. The target band of NR1D1-Promoter.D. Restriction digestion and PCR result of pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc vector: M. 5 000 bp DNA Marker; 1. Single digested product of empty vector; 2. Single digestion product of pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc vector; 3. The target band of NR1D1-Promoter圖9 pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc和pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig.9 Results of identification of pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc and pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc plasmids

A.山羊BMAL1和NR1D1基因啟動(dòng)子區(qū)域RORE元件相對(duì)于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)的位置示意圖;B、C. 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)結(jié)果。**表示差異極顯著(P<0.01)A. Schematic diagram of the position of the RORE response element in the promoter region of goat BMAL1 and NR1D1 genes relative to the transcription start site (+1) of the gene; B, C. Dual-luciferase reporter assay results. ** means the difference is extremely significant (P<0.01)圖10 RORα蛋白對(duì)山羊BMAL1和NR1D1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響Fig.10 Effects of RORα protein on the transcriptional activities of goat BMAL1 and NR1D1 promoters

自α基因在小鼠中被克隆鑒定以來(lái),人們對(duì)其生理功能的認(rèn)識(shí)不斷增加。Chen等發(fā)現(xiàn),α基因在小鼠小腦發(fā)育中起著關(guān)鍵作用,α基因缺陷小鼠表現(xiàn)出共濟(jì)失調(diào)和嚴(yán)重的小腦萎縮,其特征是浦肯野細(xì)胞明顯減少,小腦顆粒細(xì)胞丟失。Dzhagalov等研究表明,RORα在胸腺生成和淋巴細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮重要作用,α缺失小鼠的脾和胸腺都明顯較小,且成熟T和B淋巴細(xì)胞均顯著減少。此外,還有大量證據(jù)表明,RORα在視網(wǎng)膜、大腦以及T細(xì)胞等發(fā)育過(guò)程中有著重要的調(diào)控作用。同時(shí),許多研究發(fā)現(xiàn)RORα可以參與調(diào)控小鼠和人等哺乳動(dòng)物的生殖系統(tǒng)發(fā)育以及睪酮合成。Sayed等在α基因敲除小鼠睪丸中觀察到生精不足、睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少以及精子形態(tài)發(fā)生變化等現(xiàn)象。隨后,該研究又發(fā)現(xiàn)α基因突變的老年小鼠會(huì)出現(xiàn)生精小管萎縮以及精子頂體帽缺失和空泡化的現(xiàn)象。Yang等研究發(fā)現(xiàn),褪黑素可通過(guò)RORα通路來(lái)提高雄性哺乳動(dòng)物睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮合成能力。另外,在綿羊的研究發(fā)現(xiàn),褪黑素可通過(guò)RORα在體內(nèi)和體外水平上提高青春期前卵丘細(xì)胞抗氧化能力。同時(shí),在山羊精原干細(xì)胞體外分化培養(yǎng)系統(tǒng)中,褪黑素可通過(guò)RORα通路增加睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌??傊?,上述研究結(jié)果表明RORα在哺乳動(dòng)物的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中都扮演著重要角色。

哺乳動(dòng)物的生物鐘系統(tǒng)由位于SCN的中樞生物鐘和分布于機(jī)體大部分組織器官的外周生物鐘組成。肝是機(jī)體中最為主要的外周生物鐘器官,其在機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝中發(fā)揮重要作用,由相對(duì)均質(zhì)的細(xì)胞類型組成,且易于獲取。另外,生物鐘基因α作為一種重要的核受體,與肝脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)密切相關(guān),且在小鼠肝中高表達(dá)。據(jù)此推測(cè),α基因也高表達(dá)于山羊肝中,所以本研究選取山羊肝組織來(lái)提取cDNA,進(jìn)一步克隆α基因的CDS區(qū)全長(zhǎng)序列。另外,本研究還對(duì)山羊α基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,同源性分析結(jié)果顯示山羊α基因的CDS區(qū)序列與綿羊和牛等晝行性反芻動(dòng)物的α基因相似性極高,說(shuō)明此基因在反芻動(dòng)物具有較高的保守性和同源性。另外,分析系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn),進(jìn)化樹(shù)的形態(tài)與分類學(xué)基本保持一致。

此外,本研究結(jié)果還表明山羊RORα蛋白屬于一種親水性的非跨膜蛋白。通過(guò)將山羊、小鼠和人的RORα蛋白三維結(jié)構(gòu)比對(duì)后發(fā)現(xiàn),三者間存在高度的相似性,均含有4個(gè)主要功能區(qū)組成的核受體結(jié)構(gòu)域:N-末端(A/B)結(jié)構(gòu)域、高度保守的DNA結(jié)合域(DNA binding domain,DBD)、鉸鏈域和C-末端配體結(jié)合域。由于小鼠RORα蛋白的DBD已被證明可通過(guò)與特定的DNA反應(yīng)元件(RORE元件)結(jié)合來(lái)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而發(fā)揮其在生物鐘系統(tǒng)及各項(xiàng)生理過(guò)程中的調(diào)控作用。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定其功能,所以推測(cè)山羊RORα蛋白功能與小鼠之間存在保守性,其可能也在山羊生物鐘系統(tǒng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究使用了雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)探究驗(yàn)證山羊RORα蛋白的功能,結(jié)果顯示山羊RORα蛋白可以顯著上調(diào)山羊1和1D1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述猜想,證實(shí)山羊RORα蛋白確實(shí)在山羊生物鐘系統(tǒng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用。另外,結(jié)合小鼠和人RORα在調(diào)控機(jī)體生理功能方面已有的研究證據(jù)推測(cè),RORα可能在山羊的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮重要作用,但具體功能有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究克隆了山羊α基因的全長(zhǎng)CDS區(qū)片段,構(gòu)建了其真核表達(dá)載體,從mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證了α在HEK293T細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)效果,并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明,RORα蛋白在山羊與小鼠等哺乳動(dòng)物間存在高度保守性,其可以正向調(diào)控山羊1和1D1基因的啟動(dòng)子活性,為進(jìn)一步探究山羊核受體RORα的功能及山羊生物鐘的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了前期基礎(chǔ)和關(guān)鍵材料。

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