劉明璐 姜思涵 譚瑤 陳穎 羅潤(rùn)嬌 盧婷婷 王會(huì)景 付煒 游正偉 王偉

組織工程是一種將種子細(xì)胞、生物因子和支架材料相結(jié)合，形成類(lèi)似于人體組織的技術(shù)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于器官再生、體外建模、藥物篩選等領(lǐng)域[1-3]。目前常用的支架材料包括明膠、海藻酸鈉、殼聚糖、膠原蛋白、纖維蛋白等[4-7]。明膠因其良好的生物相容性、可降解性，并且具有與體內(nèi)微環(huán)境相似的特質(zhì)，是最常用的構(gòu)建體外微組織的支架材料[8]。然而，明膠機(jī)械性能差和易溶解性限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，需要通過(guò)交聯(lián)來(lái)穩(wěn)定明膠的聚合物結(jié)構(gòu)并增強(qiáng)明膠的機(jī)械性能[9-11]。明膠水凝膠交聯(lián)的方法包括離子交聯(lián)、熱凝膠、化學(xué)交聯(lián)、光聚合等[12-14]。

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Human induced pluripotent stem cells，hiPSC）來(lái)源廣泛、不涉及倫理問(wèn)題、沒(méi)有免疫排斥，并且具有向心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的潛能。目前，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源心肌細(xì)胞（Human induced pluripotent stem cellsderived cardiomyocytes，hiPSC-CMs）已經(jīng)處于比較成熟的階段，是理想的組織工程種子細(xì)胞來(lái)源[15-17]。

本研究利用明膠制備了一種新型的多功能水凝膠，并對(duì)其表面結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能、細(xì)胞相容性進(jìn)行研究，探索其混合hiPSC-CMs 構(gòu)建心肌微組織及其凍存的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

hiPSC 來(lái)自上海兒童醫(yī)學(xué)中心李彥欣教授課題組，為臍帶血細(xì)胞來(lái)源hiPSC。臍帶血捐獻(xiàn)者簽署了相關(guān)知情同意書(shū)。本研究經(jīng)上海兒童醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

泰斯曼高壓電源（大連泰思曼科技有限公司）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國(guó)）、掃描電子顯微鏡［泰思肯貿(mào)易（上海）有限公司］、倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國(guó)）、臺(tái)式單軸拉伸試驗(yàn)機(jī)（Instron 公司，美國(guó)）、流式細(xì)胞分析儀器（Beckman 公司，美國(guó)）、激光共聚焦顯微鏡（Leica 公司，德國(guó)）。

明膠（Sigma-Aldrich 公司，美國(guó)，A 型，來(lái)自豬皮）、甘油（Sigma-Aldrich 公司，美國(guó)，≥99.0%）、(NH4)2SO4（上海泰坦科技股份有限公司，≥99.5%）、戊二醛（上海麥克林生化科技有限公司，50%）、Ca(NO3)2·4H2O（國(guó)藥控股股份有限公司，≥99.0%）、EDTA（Thermo 公司，美國(guó)）、基質(zhì)膠（Cornin 公司，美國(guó)）、CHIR99021（Stemcell 公司，加拿大）、PBS 緩沖液（Hyclone 公司，美國(guó)）、TeSR-E8 培養(yǎng)基（Stemcell公司，加拿大）、減胰島素B27 添加劑（Thermo 公司，美國(guó)）、加胰島素B27 添加劑（Stemcell 公司，加拿大）、Accutase 消化酶（Stemcell 公司，加拿大）、Y-27632（Stemcell 公司，加拿大）、PMI1640（Thermo 公司，美國(guó)）、IWP-2（Stemcell 公司，加拿大）、α-Actin抗體（Sigma-Aldrich 公司，美國(guó)）、心肌細(xì)胞消化液（北京賽貝生物技術(shù)公司，中國(guó)）、肌鈣蛋白cTnT 抗體（Proteintech 公司，美國(guó)）。

1.2 材料制備

將明膠粉末與Ca(NO3)2·4H2O 溶解在去離子水中，50 ℃下持續(xù)攪拌至澄清且無(wú)氣泡。隨后抽取一定量的明膠水溶液并擠入表面皿中，放入4 ℃冰箱30 min 使其成為凝膠狀。材料由東華大學(xué)游正偉教授課題組制備。

1.3 材料冷凍掃描電鏡

將制備好的材料放入2.5%戊二醛溶液中固定過(guò)夜，在液氮中速凍30 s，-90 ℃升華10 min，之后以10 mA 的電流濺射鍍金60 s，送入掃描電鏡樣品室觀察，冷臺(tái)溫度-140 ℃，加速電壓5 kV，觀察材料的表面形態(tài)。

1.4 材料機(jī)械性能

機(jī)械性能通過(guò)萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)（MTS E42）進(jìn)行研究，進(jìn)行循環(huán)拉伸測(cè)試時(shí)，加載和卸載速率均為20 mm/min，拉伸應(yīng)變范圍為100%，循環(huán)次數(shù)為10 次。

1.5 hiPSC 的培養(yǎng)、向心肌細(xì)胞分化及鑒定

hiPSC 采用TeSR-E8 培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，EDTA 消化5 min，200× g 離心4 min 后，用含有5 μmol/L Y-27632 的TeSR-E8 培養(yǎng)基按照1∶8～1∶10 重懸，接種到6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)。每天用PBS 緩沖液清洗后，更換TeSR-E8 培養(yǎng)基。hiPSC 匯合度再次達(dá)到80%～85%時(shí)，用Accutase 消化酶消化5～7 min，200×g離心4 min 后，接種到12 孔板中，每孔1×106個(gè)hiPSC，在37 ℃、5% CO2的濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 d 后，在含有12 μmol/L CHIR99021 的TeSR-E8培養(yǎng)基中進(jìn)行分化。36 h 后更換為減胰島素B27 培養(yǎng)基，1 d 后更換為含5 μmol/L IWP-2 的減胰島素B27 培養(yǎng)基，分化第5 天更換為減胰島素B27 培養(yǎng)基。自第7 天開(kāi)始，培養(yǎng)基更換加胰島素B27 添加劑，2 d 更換一次培養(yǎng)基。第10 天可以在12 孔板中觀察到跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。

將第15 天的心肌細(xì)胞在PBS 中清洗后，用心肌細(xì)胞消化液Ⅰ消化10 min，心肌細(xì)胞消化液Ⅱ消化20 min，200× g 離心4 min 后，按1×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的激光共聚焦小皿上。待完全貼附，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，0.5% TritonX-100 室溫破膜15 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入心肌細(xì)胞標(biāo)志物cTnT 抗體（1∶200）和α-Actin 抗體（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 清洗3 次，每次5 min，添加熒光二抗（1∶1 000）室溫避光孵育2 h。DAPI（1∶1 000）室溫核染5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 明膠水凝膠與hiPSC-CMs 的細(xì)胞相容性

將明膠水凝膠剪裁成24 孔板大小，用75%乙醇浸泡30 min 消毒，PBS 清洗3 遍后，紫外線照射2 h，PBS 清洗3 遍后，將第6 天的心臟前體細(xì)胞種在材料上繼續(xù)進(jìn)行心肌細(xì)胞分化，在第15 天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行心肌標(biāo)志物染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察染色后細(xì)胞。將第15 天的心肌細(xì)胞固定后，冷凍掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料表面的形態(tài)。

1.7 hiPSC-CMs 混合明膠水凝膠構(gòu)建心肌微組織

將明膠水凝膠90 ℃水浴12 h，使其完全熔化。取第15 天的心肌細(xì)胞，PBS 清洗后用心肌細(xì)胞消化液Ⅰ消化10 min，心肌細(xì)胞消化液Ⅱ消化20 min，200× g 離心4 min 后，去上清，與交聯(lián)明膠水凝膠混合構(gòu)建心肌微組織。用Calcein-AM/ propidium iodide（1∶1 000）避光孵育30 min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的存活情況。

1.8 hiPSC-CMs 混合交聯(lián)明膠水凝膠構(gòu)建心肌微組織后凍存

hiPSC-CMs 混合交聯(lián)明膠水凝膠構(gòu)建心肌微組織后，直接放入-80 ℃冰箱凍存，24 h 后取出在37 ℃水浴鍋中復(fù)蘇，用Calcein-AM/ propidium iodide（1∶1 000）避光孵育30 min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的存活情況。

1.9 溝槽交聯(lián)明膠水凝膠

通過(guò)Adobe Illustrator 2021 設(shè)計(jì)了寬度60 μm、深度200 μm 的溝槽模具。再將交聯(lián)明膠水凝膠溶液澆筑在溝槽上，冷卻后脫膠，得到了溝槽有序排列的水凝膠。將第10 天的心肌細(xì)胞消化后，按10×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的材料上，在第15 天左右，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，0.5% TritonX-100 室溫破膜15 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入心肌細(xì)胞標(biāo)志物cTnT 抗體（1∶200）和α-actin 抗體（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 清洗3 次，每次5 min，添加熒光二抗（1∶1 000）室溫避光孵育2 h。DAPI（1∶1 000）室溫核染5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以表示，采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 明膠水凝膠的制備及鑒定

制備好的明膠水凝膠為黃色透明材料。在冷凍掃描電鏡下呈現(xiàn)出均勻疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小1～10 μm（圖1A-D）。制備的交聯(lián)水凝膠材料分別在第1 天、第3 天、第7 天進(jìn)行循環(huán)拉伸力學(xué)測(cè)試，結(jié)果顯示明膠水凝膠擁有良好的力學(xué)性能（圖1E-G）。

圖1 材料的制備及鑒定Fig.1 Preparation and identification of materials

2.2 hiPSC 的培養(yǎng)、向心肌細(xì)胞分化及鑒定

hiPSC 呈克隆樣生長(zhǎng)，排列緊密，邊緣清晰，細(xì)胞呈較小的圓形，核質(zhì)比高，細(xì)胞核顯著。在hiPSC向心肌細(xì)胞分化的過(guò)程中，通過(guò)添加小分子進(jìn)行誘導(dǎo)分化，可以觀察到hiPSC 在分化過(guò)程發(fā)生形態(tài)變化，hiPSC 從分化開(kāi)始時(shí)的緊密圓形克隆，逐漸變?yōu)榻贫贪魻畹男募〖?xì)胞，在第10 天可以看到自發(fā)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞（圖2A-E）。第15 天免疫熒光結(jié)果顯示，細(xì)胞高表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)志物cTnT、α-actin（圖2F-I）。

圖2 hiPSC 細(xì)胞培養(yǎng)、分化及鑒定Fig.2 Culture，differentiation and identification of hiPSCs

2.3 明膠水凝膠與hiPSC-CMs 的細(xì)胞相容性

將第6 天的心臟前體細(xì)胞消化后種植在明膠水凝膠膜片上，可以觀察到心肌細(xì)胞生長(zhǎng)良好，在第10 天心肌細(xì)胞開(kāi)始自發(fā)跳動(dòng)（圖3A）。第15 天的免疫熒光染色結(jié)果顯示，心肌標(biāo)志物cTnT、α-actin 在細(xì)胞高表達(dá)，表明心臟前體細(xì)胞在明膠水凝膠膜片上成功分化為心肌細(xì)胞（圖3B）。掃描電鏡結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞在材料上呈現(xiàn)典型短棒狀細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞與細(xì)胞之間出現(xiàn)細(xì)胞間連接（圖3C）。

圖3 明膠水凝膠與hiPSC-CMs 的細(xì)胞相容性Fig.3 Cell compatibility of cross-linked gelatin hydrogel with hiPSC-CMs

2.4 hiPSC-CMs 混合明膠水凝膠構(gòu)建體外心肌微組織

將交聯(lián)明膠水凝膠置于90 ℃水浴中使其完全熔化，將第15 天的心肌細(xì)胞消化后與交聯(lián)明膠水凝膠混合，構(gòu)建體外心肌微組織（圖4A）。構(gòu)建體外心肌微組織4 h 后，細(xì)胞死活實(shí)驗(yàn)顯示，活細(xì)胞占62.33%，顯著高于死細(xì)胞（36.67%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4B-E）。該結(jié)果表明，明膠水凝膠可以對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。

圖4 hiPSC-CMs 混合明膠水凝膠構(gòu)建體外心肌微組織Fig.4 hiPSC-CMs mixed gelatin hydrogel for construction of myocardial microtissue in vtro

2.5 hiPSC-CMs 混合明膠水凝膠構(gòu)建心肌微組織后凍存

hiPSC-CMs 混合明膠水凝膠構(gòu)建的心肌微組織，直接在-80 ℃凍存1 d 后進(jìn)行復(fù)蘇（圖5A-C），細(xì)胞死活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，活細(xì)胞比例為16.34%，死細(xì)胞比例為83.63%（圖5D-E），直接凍存的心肌微組織中部分細(xì)胞存活，明膠水凝膠可能通過(guò)提供類(lèi)似細(xì)胞外基質(zhì)的環(huán)境對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了保護(hù)[18]。

圖5 體外構(gòu)建心肌微組織后的凍存及復(fù)蘇Fig.5 Cryopreservation and resuscitation of myocardial microtissue constructed in vitro

2.6 溝槽明膠水凝膠結(jié)合hiPSC-CM 的初步研究

根據(jù)心肌細(xì)胞的大小和有序排列的細(xì)胞特性，設(shè)計(jì)和制備了一種有序排列的、寬度60 μm、深度200 μm 的溝槽模具，在模具中倒入明膠水凝膠溶液制備成溝槽明膠水凝膠膜片（圖6A）。有研究表明，通過(guò)表面微環(huán)境引導(dǎo)心肌細(xì)胞的有序排列有助于促進(jìn)hiPSC-CM 的成熟[19]。根據(jù)掃描電鏡結(jié)果，溝槽明膠水凝膠膜片的表面呈現(xiàn)孔徑1～10 μm 疏松多孔的超微結(jié)構(gòu)和排列整齊的溝槽（圖6B）。將第6 天的心臟前體細(xì)胞種植在溝槽明膠水凝膠膜片上，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞落在溝槽內(nèi)，在第10 天左右出現(xiàn)心肌細(xì)胞的自發(fā)搏動(dòng)并呈現(xiàn)出一定的有序排列性（圖6C）。免疫熒光結(jié)果顯示，溝槽內(nèi)心肌細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)志物cTnT、α-actin，且細(xì)胞沿溝槽有序生長(zhǎng)（圖6D）。

圖6 溝槽明膠水凝膠結(jié)合hiPSC-CMs 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Experimental results of slotted gelatin hydrogel combined with hiPSC-CMs

3 討論

組織工程是一種將種子細(xì)胞、生物因子和支架材料結(jié)合形成類(lèi)似于人體組織的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于器官再生、體外建模、藥物篩選等領(lǐng)域。常用的明膠水凝膠存在機(jī)械性能差和易溶解的問(wèn)題，許多研究都在通過(guò)各種方式致力于提高明膠作為生物墨水的各項(xiàng)性能，以實(shí)現(xiàn)其從生物材料向生物應(yīng)用的轉(zhuǎn)化[20-21]。此外，hiPSC-CMs 的分化體系目前已處于比較成熟的階段，不涉及倫理學(xué)問(wèn)題，且來(lái)源廣泛，是理想的組織工程種子細(xì)胞。本研究通過(guò)明膠交聯(lián)制備了一種多功能明膠水凝膠，可以混合hiPSC-CMs構(gòu)建體外心肌微組織，并且在長(zhǎng)時(shí)間的體外微組織構(gòu)建過(guò)程中對(duì)細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，構(gòu)建的組織可以直接凍存，且凍存后有部分細(xì)胞存活。此外，制備的溝槽明膠水凝膠對(duì)心肌細(xì)胞有一定的有序排列引導(dǎo)作用。

綜上所述，明膠水凝膠是一種多功能的組織工程支架材料，對(duì)體外構(gòu)建心肌微組織中的細(xì)胞、凍存后細(xì)胞具有保護(hù)作用。此外，溝槽明膠水凝膠對(duì)hiPSC-CMs 的排列有一定影響。后續(xù)將對(duì)明膠水凝膠圍繞體外構(gòu)建過(guò)程中面臨的抗菌、細(xì)胞保護(hù)、微組織凍存等問(wèn)題進(jìn)行深入研究，并進(jìn)一步對(duì)溝槽明膠水凝膠對(duì)hiPSC-CMs 分化、成熟的影響進(jìn)行探索。