楊艷 商穎 呂強 張振

創(chuàng)面異常愈合通常會導(dǎo)致增生性瘢痕甚至瘢痕疙瘩的形成[1-2]。增生性瘢痕可能會導(dǎo)致局部功能障礙，給患者帶來巨大的負擔(dān)[3]。目前，瘢痕治療方法眾多，但效果不一，患者接受程度也不同[4-6]。瘢痕局部注射常伴有不良反應(yīng)，且藥物無法在瘢痕組織中長期維持高濃度[7]；局部涂抹藥物具有特異性高、方便、副作用少等優(yōu)點，但藥物難以滲透致密的瘢痕組織而導(dǎo)致療效不佳[8-9]。因此，提高藥物透皮效率是改善瘢痕治療效果的重要因素。

2009 年以來，激光輔助透皮給藥治療增生性瘢痕的研究有了相關(guān)報道[10]。CO2點陣激光作為一種常用剝脫性點陣激光，通過產(chǎn)生點陣排列的微小激光束破壞皮膚角質(zhì)層和真皮層，形成致密的微孔通道，能夠迅速增加局部皮膚的藥物吸收[11]。Wang 等[12]在一項臨床研究中發(fā)現(xiàn)，CO2點陣激光聯(lián)合曲安奈德能改善瘢痕疙瘩并降低復(fù)發(fā)率，認為CO2點陣激光能很好地促進藥物透皮[13]。

絲素蛋白水凝膠（SNF）是一種具有良好生物相容性的天然納米纖維。SNF 作為一種親水-疏水-親水聚合物，能負載水溶性藥物或脂溶性藥物[14]。此外，SNF 通過緩釋給藥，延長了藥物在病灶內(nèi)的滯留時間，有助于藥物持續(xù)發(fā)揮作用[15]，是一種理想的藥物載體。積雪草苷（AC）已廣泛用于抗瘢痕治療，具有抗炎、促進傷口愈合、減少瘢痕形成的作用[16-18]。但AC 是疏水性藥物，透皮困難。

本研究通過將疏水性AC 加載于SNF，形成SNF-AC，對其進行表征，探討SNF 作為藥物載體的可行性，并評價在CO2點陣激光作用下，SNF-AC 對兔耳增生性瘢痕的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

AC（MCE，美國），高效液相色譜（Thermo Fisher，美國），C18 柱（Thermo Fisher，美國），原子力顯微鏡（Bruker Dimension ICON，德國），共焦拉曼光譜儀（InVia Qontor，Renishaw，英國），流變儀（Thermofisher Scientific，美國）。

1.2 絲素蛋白水凝膠制備

絲素蛋白溶液（質(zhì)量分數(shù)6%）60 ℃下經(jīng)過24 h濃縮到質(zhì)量分數(shù)約20%，形成亞穩(wěn)態(tài)納米顆粒，去離子水稀釋到質(zhì)量分數(shù)2%，置于60 ℃恒溫干燥箱中孵育24 h 以上，形成穩(wěn)定的水凝膠[19]。該制備過程由蘇州市現(xiàn)代絲綢技術(shù)國家工程實驗室，蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心完成。

1.3 絲素蛋白載積雪草苷水凝膠制備

將疏水的AC 溶解在甲醇中，然后與SNF（質(zhì)量分數(shù)2%）按體積比1:1 混合。200 r/min 攪拌24 h后，將混合溶液以10 000 r/min 離心30 min，分離絲素蛋白載積雪草苷水凝膠和甲醇。絲素蛋白載積雪草苷水凝膠用蒸餾水洗滌3 次以去除殘留的甲醇，制備成SNF-AC[14]。收集離心上清液計算未加載AC含量，采用高效液相色譜，C18 柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）測定溶液中AC 含量。流動相為乙腈/水（25∶75 至2 min；90∶10 至8 min；25∶75 至10 min），流速為1.0 mL/min。檢測波長為532 nm。AC 的加載效率（LE）和加載能力（LC）計算公式如下：

LE(%)＝(Wt-Wf)/Wt×100%

LC(%)＝(Wt-Wf)/Ws×100%

式中Wt 為AC 的總質(zhì)量，Wf 為上清液中未加載的AC 的質(zhì)量，Ws 為絲素蛋白水凝膠的總質(zhì)量。

1.4 絲素蛋白載積雪草苷水凝膠表征

原子力顯微鏡（AFM）檢測樣品的形態(tài)。樣品1∶1 000 稀釋，在超聲中分散10 min，然后旋涂2 μL 溶液到干凈的云母表面，用氮氣吹干表面。共焦拉曼光譜儀（532 nm 半導(dǎo)體激光器）評估SNF 中AC 的負載情況。流變儀（Mars40）測量SNF 和SNF-AC 的流變性能。25 ℃下以0.1～100 rad/s 的頻率掃描范圍內(nèi)連續(xù)采集貯存模量（G'）和損耗模量（G''），在0.1～100 s-1的剪切速度范圍內(nèi)檢測SNF-AC 和SNF 的流動曲線。

1.5 兔耳增生性瘢痕模型

成年雄性新西蘭大白兔6 只，體質(zhì)量約2 kg，單籠飼養(yǎng)2 周（SLAC，上海）。鹽酸賽拉嗪注射液（陸眠寧）聯(lián)合氯胺酮按每100 克體質(zhì)量1.5 mg 肌內(nèi)注射麻醉。在兔耳上用手術(shù)刀產(chǎn)生直徑為1 cm 的圓形傷口，去除全層皮膚和軟骨膜，保留軟骨。每個兔耳上產(chǎn)生4 個傷口，所有傷口均環(huán)繞兔耳中點，均勻分布。28 d 后兔耳創(chuàng)面愈合完全，可見直徑約0.9 cm 的增生性瘢痕，顏色鮮紅，質(zhì)硬。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)（SH9H-2019-TK206-1）。

將48 個成熟的兔耳增生性瘢痕隨機分為4 組（每組12 個）：①L+SNF-AC 組，CO2點陣激光處理后，在增生性瘢痕表面涂抹2.5 mg/mL SNF-AC 100 μL，每天2 次；②L 組，CO2點陣激光處理；③SNF-AC 組，只涂抹SNF-AC 2.5 mg/mL 100 μL，每天2 次；④Control 組，即空白對照組，無任何處理。激光治療參數(shù)：DeepFX 模式，能量密度25 mJ，覆蓋率20%，頻率300 Hz，10 號光斑大小，治療1 次。

分別在治療后第7、14 天，靜脈注射過量戊巴比妥鈉處死實驗兔，用帶表卡尺測量增生性瘢痕厚度，獲取兩處讀數(shù)，A 為單個兔耳增生性瘢痕組織最高處的厚度，B 為離該最高處1.0 cm 兔耳皮膚厚度（靠近兔耳中心點處）。計算相對厚度公式如下：相對厚度＝A/B（相對厚度變化值即為治療前后相對厚度的差值）。2 名皮膚科醫(yī)生肉眼評估瘢痕的血管分布情況。根據(jù)溫哥華瘢痕量表評估增生性瘢痕模型。大體觀察后將標(biāo)本以4%多聚甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片（厚度7 μm），分別行HE 染色和Masson染色，觀察各組增生性瘢痕的組織結(jié)構(gòu)和膠原纖維的變化情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用GraphPad Prism 軟件（Version 9.00，GraphPad Software，美國），數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絲素蛋白載積雪草苷水凝膠表征

原子力顯微鏡顯示，加載AC 后絲素蛋白納米纖維絲的直徑略有增加，但無明顯聚集，表明藥物黏附于絲素蛋白納米纖維絲并呈現(xiàn)均勻分布（圖1A、B）。SNF 的流變學(xué)特性，包括貯存模量（G'）、損耗模量（G''）和黏度，在加載AC 后沒有出現(xiàn)明顯變化（圖1C、D）。SNF-AC 的拉曼光譜既在450～650 cm-1表現(xiàn)出典型的AC 峰，又在1 669 cm-1表現(xiàn)出典型的SNF 峰，證明了AC 的成功加載（圖1E）。將4 mg/mL AC 加載到SNF 中，最終獲得含有2.832 mg/mL AC的SNF-AC，其LE 為70.8%，LC 為0.283%。

圖1 絲素蛋白水凝膠和絲素蛋白負載積雪草苷水凝膠的表征Fig.1 Characterization of SNF and SNF-AC

2.2 兔耳增生性瘢痕治療結(jié)果

治療后第7、14 天，4 組的相對瘢痕厚度均降低，第7 天時，L+SNF-AC 組＞L 組＞SNF-AC 組＞Control 組，且L+SNF-AC 組和L 組的相對厚度變化值顯著高于Control 組（L+SNF-AC 組vs Control 組，P＜0.01；L 組vs Control 組，P＜0.05，圖2A）。第14 天時，L+SNF-AC 組相對厚度變化值均高于其他3 組，但各組間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，圖2B）。

瘢痕的血管分布評測發(fā)現(xiàn)，各組治療后均有所改善。L+SNF-AC 組的增生性瘢痕從鮮紫紅色變成與周圍皮膚顏色相近（圖3A、E、I）；L 組的增生性瘢痕顏色從鮮紫紅色變成膚色偏粉紅（圖3B、F、J）；SNF 組（圖3C、G、K）和Control 組（圖3D、H、L）略有改善，但顏色仍為紅色。第7 天時，血管分布評分改變（圖2C）：L+SNF-AC 組＞L 組＞Control 組＞SNF-AC組，且L+SNF-AC 組血管分布評分改變顯著優(yōu)于其余3 組（L+SNF-AC 組vs L 組，P＜0.05；L+SNF-AC組vs SNF-AC 組，P＜0.01；L+SNF-AC 組vs Control組，P＜0.01）。第14 天血管分布評分改變（圖2D）：L+SNF-AC 組也顯著優(yōu)于其余3 組（L+SNF-AC 組vs L 組，P ＜0.001；L+SNF-AC 組vs SNF-AC 組，P＜0.001；L+SNF-AC 組vs Control 組，P＜0.000 1）。

圖2 兔耳增生性瘢痕治療后相對厚度變化和血管分布變化Fig.2 Relative thickness change and vascularity change of rabbit ear hypertrophic scars after treatment

圖3 兔耳增生性瘢痕（標(biāo)尺：2.5 mm）Fig.3 Rabbit ear hypertrophic scars (Scale bar:2.5 mm)

增生性瘢痕HE 染色顯示，治療后第14 天L+SNF-AC 組增生性瘢痕表面趨于平整，而其余3 組增生性瘢痕表面均有不同程度凸起（圖4）。Masson染色結(jié)果顯示，治療后第14 天，L+SNF-AC 組和L組的膠原纖維較整齊，接近正常皮膚組織，而SNFAC 組和Control 組的膠原排列紊亂（圖5）。

圖4 兔耳增生性瘢痕HE 染色Fig.4 HE staining of rabbit ear hypertrophic scar

圖5 兔耳增生性瘢痕Masson 染色（標(biāo)尺：50 μm）Fig.5 Masson staining of rabbit ear hypertrophic scar (Scale bar:50 μm)

3 討論

增生性瘢痕的臨床治療方法有手術(shù)治療和非手術(shù)治療，但均無法達到理想的治療效果[20]。在非手術(shù)方式中，藥物是主要的治療方法。其中，局部涂抹藥物具有方便、無痛、穩(wěn)定、副作用小、不經(jīng)胃腸道環(huán)境影響等優(yōu)點，但增生性瘢痕角質(zhì)層增厚，真皮增生，藥物的滲透被阻礙，很難達到有效的治療濃度[9]。CO2點陣激光主要用于臨床治療面部皺紋、淺表性瘢痕、色素沉著障礙和改善皮膚質(zhì)地[21]。此外，CO2點陣激光可在皮膚表面產(chǎn)生微孔通道，破壞皮膚屏障，誘導(dǎo)傷口愈合反應(yīng)，可很好地促進藥物透皮[22]。

SNF 是一種生物相容性較好的天然生物材料，能夠有效加載不同親疏水性的藥物，在保持藥物活性的同時實現(xiàn)長效的可控釋放，是藥物的理想載體[14]；且SNF 具有高載藥特性，其藥物加載能力比傳統(tǒng)藥物載體脂質(zhì)體高7 倍[15]。這些特性使SNF 能廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域。例如，Ding 等[23]將SNF 載去鐵胺，用于治療糖尿病創(chuàng)面，SNF 載去鐵胺比單獨使用去鐵胺能更有效地促進血管生成，緩解慢性炎癥反應(yīng)，加快創(chuàng)面愈合。Wu 等[24]將阿霉素加載到SNF，實現(xiàn)化療藥物在局部長達8 周的緩釋，有效抑制了腫瘤的生長。SNF 不僅提高了藥物的穩(wěn)定性，而且通過緩釋調(diào)控，有效加強藥物的藥理作用[25]。本研究成功將抗瘢痕藥物AC 加載到SNF，并結(jié)合CO2點陣激光，增加藥物的滲透，提高瘢痕的治療效果。

本研究結(jié)果顯示，治療后第7 天，L+SNF-AC 組和L 組增生性瘢痕相對厚度相比Control 組顯著改善，提示CO2點陣激光處理增生性瘢痕后，能夠顯著減少增生性瘢痕的厚度。CO2點陣激光可通過光熱作用，去除表皮和部分真皮，上調(diào)多種金屬基質(zhì)蛋白酶，促進組織重塑[26]，已被用于改善增生性瘢痕的顏色和質(zhì)地[27]。Zhang 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，CO2點陣激光能夠促進增生性瘢痕的膠原重塑，從而減少瘢痕厚度。

此外，L+SNF-AC 組的血管分布改善顯著，瘢痕組織內(nèi)的充血減輕?？赡艿脑颍孩貱O2點陣激光能夠加速并促進藥物透皮。多個研究證明，經(jīng)過CO2點陣激光處理后，體外皮膚中5-氟尿嘧啶、順鉑或甲氨蝶呤的含量顯著增加[13，29，30]。②AC 可減少炎癥細胞浸潤，抑制炎癥介質(zhì)如IL-6、TNF-α 的表達[31]，而瘢痕組織內(nèi)的慢性炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致血管生成，成纖維細胞增殖，膠原沉積[1]。③相比于AC，SNF-AC 能夠通過長期緩釋AC，顯著減少傷口愈合中炎癥因子IL-6 和TNF-α 含量，從而減輕傷口炎癥反應(yīng)，并促進傷口愈合，減少瘢痕形成[15，25]。本研究中，SNFAC 利用CO2點陣激光產(chǎn)生的臨時微孔通道，進入并布滿于微孔通道內(nèi)，當(dāng)通道閉合，已進入瘢痕組織內(nèi)的SNF-AC 固定在局部起到緩釋藥物的作用，最終達到持續(xù)治療增生性瘢痕的作用。

綜上所述，在CO2點陣激光協(xié)同下，SNF-AC 對增生性瘢痕具有良好的治療效果，有助于減少增生性瘢痕的相對厚度，并改善血管分布。SNF 可作為抗瘢痕藥物積雪草苷的有效載體。這為實現(xiàn)藥物透皮后的局部給藥以及增生性瘢痕的治療提供一種創(chuàng)新且可行的治療方法。