劉泓源 顧豪 楊希 胡麗 徐梓安 陳輝 林曉曦

靜脈/淋巴管畸形是常見的先天性低流量脈管畸形。根據(jù)國際脈管性疾病研究學(xué)會的最新分類[1]，靜脈/淋巴管畸形可以作為單純的脈管畸形單獨出現(xiàn)，如靜脈畸形、淋巴管畸形；也可存在混合脈管畸形成分（如淋巴靜脈畸形），或合并過度生長作為綜合征出現(xiàn)（如血管骨肥大綜合征）。既往針對靜脈/淋巴管畸形的診斷主要依賴于典型的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)和病理診斷[2-3]，但對于混雜成分的診斷往往存在一定困難，主要表現(xiàn)為臨床表現(xiàn)多樣而不典型，影像學(xué)難以區(qū)分靜脈或淋巴管畸形成分，病理表現(xiàn)不典型導(dǎo)致病例診斷僅能提供傾向性結(jié)論，并且不同個體的疾病發(fā)展差異巨大。因而，靜脈/淋巴管畸形的鑒別診斷亟需尋求新的突破途徑。

在遺傳性疾病中，基因診斷是疾病診斷和預(yù)后判斷的關(guān)鍵。在腫瘤研究中，基因診斷已經(jīng)逐漸發(fā)展成為了臨床診斷和病理診斷之外的第三種診斷方法，對于腫瘤發(fā)現(xiàn)、預(yù)后、治療起到關(guān)鍵作用。第二代測序技術(shù)廣泛應(yīng)用后，基因診斷在非腫瘤領(lǐng)域和非遺傳性疾病領(lǐng)域逐漸發(fā)揮重要作用。在脈管畸形領(lǐng)域，基因水平的研究不僅能幫助我們更好地理解脈管畸形發(fā)生發(fā)展的機制，也有望形成基因診斷模式，推進疾病的精準診斷和治療。

本研究中，我們通過第二代測序技術(shù)，檢測了55 例靜脈/淋巴管畸形患者的組織、血漿或淋巴液，分析基因突變情況，并嘗試提出靜脈/淋巴管畸形的基因分型。

1 材料與方法

1.1 患者選擇與標本獲取

調(diào)取2019 年9 月至2020 年12 月在復(fù)雜血管瘤與脈管畸形樣本庫中留存的55 例靜脈/淋巴管畸形患者組織樣本，所有組織樣本均經(jīng)病理證實存在靜脈/淋巴管畸形成分。對組織樣本進行組織DNA的靶向捕獲二代測序。全部送檢樣本均達到基因測序質(zhì)控要求。所有患者均簽署了樣本庫統(tǒng)一的知情同意書。

1.2 DNA 測序

基因二代測序由寧波愛她基因科技有限公司完成。具體步驟如下：使用Qiagen DNA 提取試劑盒抽提組織樣本中的DNA。采用VAHTSTM Universal DNA Library Prep Kit for IlluminaV3 和VAHTS DNA Adapters set 3/4 for Illumina進行DNA 文庫構(gòu)建。基因組DNA 初始量為500 ng，使用Covaris 超聲將基因組DNA 隨機打斷為200～300 bp 的片段后。將DNA 片段進行末端修復(fù)，使DNA 雙鏈形成平末端，并分別在片段化的DNA 的5' 端加磷酸基團，3' 端加PolyA 尾。通過TA 互補配對連接將DNA adapter 序列加到片段兩端，經(jīng)過一輪PCR擴增后成為完整的片段文庫。將片段文庫純化并分選后，先進行擴增富集，純化后使用Qubit 3.0 熒光定量儀測定DNA 濃度。靶向捕獲二代測序使用定制的AT134pool01 和AT134pool02 探針進行目標區(qū)域捕獲，將擴增后的樣品與探針進行雜交，形成外顯子區(qū)域和探針復(fù)合體；使用試劑盒中配套納米磁珠吸附上一步得到的復(fù)合體，清洗磁珠，去除未結(jié)合序列，然后將捕獲的外顯子序列洗脫下來，通過PCR擴增構(gòu)建外顯子文庫，經(jīng)純化后使用Qubit 3.0 熒光定量儀測定DNA 濃度。外顯子文庫經(jīng)過質(zhì)檢合格后，生成DNA 簇，使用Illumina Nova Seq 6000 高通量測序儀進行測序，Panel 文庫經(jīng)過質(zhì)檢合格后，生成DNA 簇，使用深圳華大智造科技有限公司的DNBSEQ-T7RS 測序儀進行測序。獲得圖片文件，經(jīng)過初級分析獲取光強數(shù)據(jù)并均一化后，讀取堿基序列并過濾，完成數(shù)據(jù)質(zhì)量打分。質(zhì)量評估合格后進行數(shù)據(jù)拆分，將多個混合樣品通過特定的index 標記進行區(qū)分，并生成相應(yīng)的原始測序序列，以FASTQ 文件格式進行存儲。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 序列質(zhì)量評估和控制

對原始測序序列進行二級分析，去除接頭序列、N 含量大于10%的reads、質(zhì)量低于10 的堿基超過50%的序列，從而獲得可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析的Clean reads。堿基類型分布檢查后無AT、GC 分離現(xiàn)象。

1.3.2 基因組對比

通過序列對比軟件BWA，將達到標準的Clean reads 與人參考基因組序列（GRCh37，hg9）對比，去除結(jié)果文件中冗余序列，對比獲得SAM 格式文件，進一步處理為二進制格式BAM 文件。BAM 文件通過SAMTOOLS 或IGV 軟件（Integrative Genomics Viewer）查看。用Picard 對比對結(jié)果進行排序，然后標記重復(fù)reads（Mark duplicate reads），最后利用重復(fù)標記后的比對結(jié)果進行覆蓋度、深度等的統(tǒng)計。

1.3.3 SNV 和插入/缺失（InDel）的檢測和注釋

SNV 和small InDel 的檢測主要使用GATK 軟件工具包實現(xiàn)。根據(jù)Clean reads 在參考基因組的定位結(jié)果，使用Picard 進行去重復(fù)（Mark duplicates）、GATK 進行局部重比對（Local realignment）、堿基質(zhì)量值校正（Base recalibration）等預(yù)處理，以保證檢測結(jié)果的準確性；再使用GATK 進行SNV 和InDel 的檢測，過濾，并得到最終的變異位點集。

1.3.4 變異結(jié)果注釋

注釋變異結(jié)果主要通過ANNOVAR 軟件實現(xiàn)，根據(jù)變異位點在參考基因組上的位置以及參考基因組上的基因位置信息，可以得到變異位點在基因組發(fā)生的區(qū)域（基因間區(qū)、外顯子區(qū)或UTR 區(qū)等），以及變異產(chǎn)生的影響（同義突變、非同義突變、移碼突變等）。具體注釋信息，分為6 個部分：變異位點位置和功能區(qū)域信息注釋、數(shù)據(jù)庫頻率注釋、保守/有害性注釋、各樣本基因型信息注釋、疾病數(shù)據(jù)庫注釋以及變異基因功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 靜脈/淋巴管畸形的臨床特征

55 例診斷為靜脈/淋巴管畸形的患者中，單純靜脈畸形19 例，單純淋巴管畸形10 例，淋巴靜脈畸形8 例，毛細血管淋巴靜脈畸形4 例，血管骨肥大綜合征14 例。

2.2 靜脈/淋巴管畸形的基因檢測結(jié)果

55 個靜脈/淋巴管畸形組織樣品進行DNA 的靶向捕獲二代測序，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，篩選與受檢者臨床表型相關(guān)的致病或可能致病的變異，排除胚系突變和意義不明的體細胞突變后，發(fā)現(xiàn)3 種潛在致病基因、15 個變異位點。綜合分析每例患者的基因檢測結(jié)果，55 例患者中發(fā)現(xiàn)18 例存在TEK 突變、22 例存在PIK3CA 突變，1 例存在RASA1 突變，17 例沒有發(fā)現(xiàn)與受檢者臨床表型相關(guān)的致病或可能致病的變異。

根據(jù)疾病的臨床診斷和病理診斷進行臨床分類，分為單純靜脈畸形、單純淋巴管畸形、淋巴靜脈畸形、毛細血管淋巴靜脈畸形和血管骨肥大綜合征，其突變基因各有特征，具體見表1。

表1 不同疾病亞型的基因分型Table 1 The genotyping of different malformations

在單純靜脈畸形中，68.42%存在TEK 突變，其中最常見的突變是TEK L914F 點突變，占TEK 突變的76.92%；5.26%存在PIK3CA 突變；其余5 例均未檢測出與受檢者臨床表型相關(guān)的致病或可能致病的變異。

在單純淋巴管畸形中，40%存在PIK3CA 突變，其中最常見的突變是E542K 點突變，占PIK3CA 突變的50%；1 例同時存在TEK R614fs 突變和PIK3CA E542K 突變；1 例患者檢出RASA1 R903del缺失突變；其余4 例均未檢測出與受檢者臨床表型相關(guān)的致病或可能致病的變異。

在淋巴靜脈畸形中，37.5%存在PIK3CA 突變，其中2 例為E542K 點突變、1 例為E545G 點突變；1例存在TEK R614fs 突變和PIK3CA E545K 突變；其余4 例均未檢測出與受檢者臨床表型相關(guān)的致病或可能致病的變異。

4 例毛細血管淋巴靜脈畸形中，2 例為TEK 突變，1 例為PIK3CA 突變，1 例未檢測出與臨床表型相關(guān)的致病或可能致病突變。

在血管骨肥大綜合征中，71.43%存在PIK3CA突變，其中最常見的突變位點是E545K、C420R，分別占PIK3CA 突變的36.36%和27.27%；1 例同時存在TEK R50L 點突變和PIK3CA E545K 點突變；21.43%的血管骨肥大綜合征患者未檢出與受檢者臨床表型相關(guān)的致病或可能致病的變異。

就靜脈/淋巴管畸形所檢測出的各基因的突變情況而言，單純TEK 突變中86.67%為單純靜脈畸形，100%伴有靜脈畸形成分。單純PIK3CA 突變中52.63%為血管骨肥大綜合征，21.05%為單純淋巴管畸形，94.74%伴有淋巴管畸形成分（表2）。就各基因的變異位點而言，TEK 最常見的變異位點為L914F，占TEK 突變的57%，PIK3CA 最常見的變異位點為E542K、E545K，分別占PIK3CA 突變的31.81%和27.27%。

表2 基因分型的表型特征Table 2 The phenotype of different genotypings

3 討論

隨著遺傳學(xué)、分子生物學(xué)理論與技術(shù)的飛速發(fā)展，從更為本源的角度——基因水平來探索脈管畸形這一古老疾病是必然的選擇。第二代測序技術(shù)（Next-generation sequencing，NGS）的廣泛應(yīng)用使得探究脈管畸形發(fā)生發(fā)展的根本原因成為可能。

在既往的研究中，RAS/Raf/MEK/ERK 通路和PI3K/AKT/mTOR 通路是脈管畸形中兩條最為關(guān)鍵的信號通路[4]，大多數(shù)脈管畸形相關(guān)的突變基因都集中于此。我們的研究明確了靜脈/淋巴管畸形的基因突變類型和常見的熱點突變位點。

這部分研究中，我們結(jié)合病灶組織的靶向捕獲二代測序、靜脈畸形病灶血液的游離DNA 靶向捕獲二代測序和病灶組織的全外顯子測序等3 種檢測方式，篩選出7 種與疾病表型有關(guān)的致病或可能致病的變異基因，其中2 種與PI3K/AKT/mTOR 通路相關(guān)，4 種與RAS/Raf/MEK/ERK 通路相關(guān)。靜脈/淋巴管畸形最常見的突變基因為TEK 和PIK3CA，均與PI3K/AKT/mTOR 通路相關(guān)，表明該通路在疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有極為重要的作用。

在靜脈畸形中，我們確認了TEK 是最主要的突變基因，少部分存在PIK3CA 基因突變，1 例存在GLMN 突變被認為是一種特殊類型的靜脈畸形——球細胞靜脈畸形。考慮到游離DNA 靶向捕獲二代測序的總體檢出率明顯低于組織樣本的靶向捕獲二代測序，如果僅參考組織樣本的靶向捕獲二代測序結(jié)果，靜脈畸形的活檢病灶組織樣本中75.86%存在TEK 基因突變，3.45%存在PIK3CA 突變，20.69%未檢測出TEK 或PIK3CA 基因突變。因此，我們可以推斷，靜脈畸形中發(fā)生突變的最主要的基因是TEK，而TEK 突變的檢出提示存在靜脈畸形的成分。

在淋巴管畸形和淋巴靜脈畸形中，我們確認了PIK3CA 是主要的突變基因，也有同時存在TEK 和PIKCA 兩種基因突變的情況發(fā)生，而40%的淋巴管畸形和42.86%的淋巴靜脈畸形并未檢出與受檢者臨床表型相關(guān)的致病或可能致病的變異。我們推測，在部分淋巴管畸形和淋巴靜脈畸形的患者中可能存在其他沒有涵蓋在我們測序靶向捕獲列表中的致病基因突變，或者一些臨床意義不明的變異也參與了淋巴管畸形和淋巴靜脈畸形的發(fā)生發(fā)展。

在其他的多種病灶成分同時存在的混合畸形中，TEK 和PIK3CA 基因突變均被發(fā)現(xiàn)，但由于總體的患者數(shù)量較少，不足以確認哪一種基因是主要的突變基因，以及是否還存在其他潛在可能的基因突變類型，但PIK3CA 突變的檢出提示存在淋巴管畸形的成分。

在血管骨肥大綜合征中，PIK3CA 是最主要的突變基因。有觀點認為這一疾病應(yīng)該屬于PIK3CA相關(guān)過度生長綜合征群（PROS）[4-7]。PROS 包括了一大類散發(fā)性過度生長綜合征，包括纖維脂肪性過度增生（FAO）、偏側(cè)過度增生性多發(fā)性脂肪瘤病、CLOVES 綜合征、巨趾/指畸形、纖維脂肪性浸潤性脂肪瘤病及相關(guān)巨腦畸形綜合征、巨腦畸形-毛細血管畸形綜合征、發(fā)育不良型巨腦畸形等[3，5，8-9]。脈管畸形是PROS 診斷標準的重要部分，大部分患者均存在各種類型、各種成分的脈管畸形。在傳統(tǒng)的經(jīng)典定義中，血管骨肥大綜合征并沒有被歸類到PROS 的疾病譜系中去，但是根據(jù)PROS 的診斷標準，血管骨肥大綜合征的患者存在包括脂肪、肌肉、骨骼在內(nèi)的一種或多種組織過度生長，存在毛細血管、靜脈、淋巴管一種或多種脈管畸形成分，符合PROS 疾病的定義和診斷，因而從臨床表現(xiàn)或表型的角度可以被歸屬到這一疾病譜系中。我們的研究進一步驗證了血管骨肥大綜合征的基因突變類型是PIK3CA 基因突變，進一步論證了將血管骨肥大綜合征歸類到PROS 的合理性。

綜合所有的基因檢測結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)TEK 基因最常見的熱點突變位點是L914F，PIK3CA 基因最常見的突變位點是E542K 和E545K。在腫瘤學(xué)中，組織細胞的TEK 突變是罕見的，因而TEK L914F 這一熱點突變可能是靜脈畸形相關(guān)的獨特突變類型，而PIK3CA 的熱點突變位點與腫瘤中發(fā)現(xiàn)的熱點突變位點相一致[10]。

根據(jù)以上結(jié)果分析，我們認為靜脈/淋巴管畸形的致病基因是TEK 和/或PIK3CA，并且TEK 突變很可能僅與靜脈畸形有關(guān)。因此，我們提出靜脈/淋巴管畸形的基因分型：TEK 突變型（僅存在TEK 突變）、PIK3CA 突變型（僅存在PIK3CA 突變）、雙突變型（同時存在TEK 和PIK3CA 突變）和無突變型（不存在TEK 或PIK3CA 突變），如圖1 所示。TEK 突變型高度提示存在靜脈畸形成分，所對應(yīng)表型一般為單純的靜脈畸形。PIK3CA 突變型提示可能存在淋巴管畸形成分，對應(yīng)表型可以是單純的淋巴管畸形也可以是混合畸形或血管骨肥大綜合征。雙突變型提示可能存在混合成分的靜脈/淋巴管畸形或血管骨肥大綜合征。無突變型作為陰性結(jié)果，可能發(fā)生于各種類型的靜脈/淋巴管畸形中。需要注意的是，以上結(jié)果的判斷應(yīng)當(dāng)以組織樣本的靶向捕獲二代測序的結(jié)果為準，以避免假陰性（即被錯誤地歸類到無突變型）的產(chǎn)生。靜脈/淋巴管畸形基因分型的提出，成為了這一疾病在臨床診斷、病理診斷之外的獨立診斷模式，有助于更好地鑒別臨床表現(xiàn)不典型、影像學(xué)表現(xiàn)不典型的靜脈/淋巴管畸形，同時也為靜脈/淋巴管畸形的精準醫(yī)療和靶向治療提供了依據(jù)。

圖1 基因分型在靜脈/淋巴管畸形診斷與治療選擇中的意義Fig.1 The meaning of genotyping in diagnosis and treatment of venous/lymphatic malformations.

西羅莫司作為目前唯一能夠用于靜脈/淋巴管畸形的靶向藥物，其療效與基因突變的關(guān)系尚未明確[11]，而已有的指南、文獻、臨床研究登記中，尚無西羅莫司以外其他靶向藥物用于靜脈/淋巴管畸形精準用藥的研究，特別是基因突變相關(guān)的適應(yīng)證。包括PI3Kα 選擇性抑制劑、MEK 抑制劑在內(nèi)的多種靶向新藥目前已開展針對實體腫瘤的臨床研究[12]，但由于缺乏在脈管畸形領(lǐng)域的臨床研究，無法用于脈管畸形的治療，使之成為了靜脈/淋巴管畸形精準治療領(lǐng)域的瓶頸所在。同時，由于相關(guān)用藥指南的缺乏，對于復(fù)雜靜脈、淋巴管畸形的治療缺乏規(guī)范與針對性，徒然增加了用藥風(fēng)險與成本，西羅莫司導(dǎo)致機會性感染引起死亡的案例報告時有出現(xiàn)[13-14]。本研究所提出的靜脈/淋巴管畸形的4 種基因分型有助于我們更好地理解靜脈/淋巴管畸形的發(fā)病機制，幫助后續(xù)進行療效與基因突變關(guān)系的研究，并有望能夠成為靶向用藥的指征。