陳 恂 彭征屏 冀曉華

（中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091）

兒童哮喘是兒童期最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，是增加兒童急診及住院次數(shù)的重要原因，極大地加重了經濟和社會負擔［1］。新近流行病學調查顯示，我國20歲及以上人群哮喘患病率達4.2%［2］，增長率加快［3-4］。兒童哮喘如若控制不良將嚴重影響患兒日后的生長發(fā)育，并造成不可逆的肺功能受損，甚至死亡［5-6］，因此早期診斷、早期干預和規(guī)范化管理是提高兒童哮喘控制水平和改善預后的重要手段［4］。氣道重塑是兒童哮喘主要的病理改變［7］，是造成不可逆氣流受限和持續(xù)氣道反應的最重要原因，但目前其調控機制尚不清楚［8］。氣道高反應是兒童哮喘的主要病理特征，而氣道慢性炎癥是造成氣道高反應的主要原因，研究表明哮喘患兒早期通氣肺功能改變并不明顯，而此時即可出現(xiàn)小氣道功能下降，并與氣道高反應性密切相關［9-11］。

小兒止哮平喘顆粒是中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院的院內制劑，長期的臨床應用發(fā)現(xiàn)其在兒童哮喘的治療中療效卓著。本研究擬通過OVA霧化吸入并激發(fā)建立幼齡豚鼠哮喘模型，初步探討小兒止哮平喘顆粒對氣道重塑及小氣道功能的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級幼齡豚鼠50只，3周齡，體質量140～160 g，雌雄各半，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011，均飼養(yǎng)于北SPF級動物房中，室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，換氣次數(shù)≥15次/h，維持12 h/12 h晝夜交替光照。實驗前適應性飼養(yǎng)7 d，以全價顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。實驗中對實驗動物的處理遵循3R原則。動物福利通過北京盈科瑞藥物安全有效性研究有限公司審查（審批號：YKR-2020-003）。

1.2 試藥及儀器 小兒止哮平喘顆粒：主要成分為麻黃、杏仁、黃芩、地骨皮、赤芍、丹參、地龍、紫蘇子、葶藶子、仙鶴草；院內制劑，京藥制備字Z20200066000，批號191201，生藥含量4.85g/g，黃棕色顆粒劑。卵白蛋白（OVA）：規(guī)格25 g/瓶，購自Sigma公司，批號A5253。小動物肺功能儀（Emka Technologies Inc WBP型）、小動物口鼻暴露系統(tǒng)（北京慧榮和HRH-MNE302型）、自動組織脫水機（Leica HistoCore PEARL）、生物組織包埋機（浙江科迪KD-BM）、包埋機冷凍臺（浙江科迪KD-BL）、石蠟切片機（Leica RM2235）、生物組織攤片機（浙江科迪KD-P）、生物組織烘片機（浙江科迪KDH）、電熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣DGG-9140A）、自動染片機（SAKURA DRS 2000JC-D2）、光學顯微鏡（OLYMPUS BX43）。

1.3 分組與造模 幼齡豚鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組，每組10只，雌雄各半。除空白對照組外，其余各組腹腔注射卵白蛋白1 mL致敏。間隔1周，進行第2次致敏。

1.4 給藥方法 第2次致敏次日開始灌胃給藥，中藥高、中、低劑量組劑量分別為17.2、8.6、4.3 g/kg，給藥體積均為10 mL/kg。每天1次，連續(xù)給藥7 d?？瞻捉M、模型組予等量生理鹽水灌胃。各組均在末次給藥后霧化OVA溶液（4 mg/mL）激發(fā)40 min。

1.5 觀察指標 1）肺功能。各組在OVA激發(fā)結束后進行肺功能測定，計算支氣管收縮系數(shù)（PENH）。2）組織病理學染色。處死豚鼠，取右肺置10%甲醛溶液中固定，脫水，切片。將病理切片行蘇木精-伊紅（HE）染色，用顯微鏡觀察肺組織病理變化。3）肺組織小氣道形態(tài)學檢測。用Image j圖形軟件分析測定肺內支氣管基底膜周徑（Phm）、總管壁面積（Wat）及平滑肌面積（Wam）。用Phm將Wat和Wam標準化，得到Wat/Phm和Wam/Phm的比值，用以比較每組支氣管內管壁與平滑肌的厚度的變化［12］。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料以（±s）表示，采用Komogorov-Smirnov檢驗（樣本量≥5）和Q-Q圖分析是否滿足正態(tài)分布，不滿足正態(tài)分布的組間比較采用秩和檢驗，滿足正態(tài)分布行Levene檢驗判定方差齊性，方差齊時組間比較采用獨立樣本t檢驗，不齊時采用t′檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組幼齡豚鼠肺組織小氣道病理形態(tài)學改變

空白組鏡下可見：肺內小氣道上皮完整，連續(xù)光滑，無水腫及增厚壞死，管腔規(guī)則無狹窄，周圍無炎癥細胞浸潤。模型組鏡下可見：肺內小氣道上皮脫落，不連續(xù)，黏膜水腫，管腔狹窄，可見痰拴，氣道管壁及基底層明顯增厚，支氣管平滑肌細胞明顯增生，氣道可見大量炎性細胞浸潤，包括肥大細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等，與模型組相比，中藥各劑量組在炎性細胞浸潤、支氣管壁增厚及平滑肌增生、氣道上皮水腫、管腔狹窄方面都有不同程度的改善，中藥高劑量組和空白組幾無差異。見圖1。

圖1 各組豚鼠肺組織小氣道病理形態(tài)學改變（HE染色）

2.2 各組幼齡豚鼠肺組織小氣道形態(tài)學指標比較

見表1。Wat/Phm：與空白組相比，模型組顯著增厚（P＜0.01）；中藥各劑量組較模型組均顯著降低（P＜0.01），與空白組相比無明顯差異（P＞0.05）。Wam/Phm：與空白組相比，模型組與中藥低劑量組顯著增厚（P＜0.01）；中藥各劑量組較模型組均顯著降低（P＜0.01），中藥中、高劑量組與空白組相比無明顯差異（P＞0.05）。

表1 各組豚鼠Wat/Phm及Wam/Phm比較（±s）

表1 各組豚鼠Wat/Phm及Wam/Phm比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。下同。

組別空白組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 Wat/Phm 45.65±4.47 107.66±15.17**54.66±7.65##44.62±1.11##39.25±3.82##Wam/Phm 22.57±3.60 58.26±2.37***39.70±4.25**##29.77±1.38###21.77±3.19###

2.3 各組幼齡豚鼠肺功能結果比較 見表2。與空白組相比，模型組PENH顯著增高（P＜0.01）；中藥各劑量組較模型組均有降低，其中，中藥高劑量組與模型組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

表2 各組幼齡豚鼠肺功能PENH比較（±s）

表2 各組幼齡豚鼠肺功能PENH比較（±s）

組別空白組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 PENH 0.40±0.10##3.62±3.14 2.29±3.26 1.75±0.99 1.24±1.26#

3 討 論

中醫(yī)學認為哮的病因病機為“本為肺脾腎三臟不足，內有痰瘀伏肺，外有風邪為患”。小兒止哮平喘顆粒為中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院著名兒科專家安效先教授根據(jù)“風痰瘀”理論結合多年臨床經驗組方而成，作為中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院院內制劑長期應用，在治療兒童哮喘和咳嗽變應性哮喘方面療效顯著。方中麻黃、杏仁一宣一降恢復肺氣升降，并予地龍祛內、外之風，黃芩、地骨皮清瀉肺火，丹參、赤芍活血化瘀，紫蘇子、葶藶子降氣豁痰平喘，仙鶴草斂肺補中，諸藥合用，共奏宣肺清熱、止哮滌痰、化瘀平喘之功。體內研究已證實，小兒止哮平喘顆粒能延長咳嗽、喘憋潛伏期，促進酚紅排泌，具有止咳、化痰和平喘作用［13］。

氣道重塑是兒童哮喘等慢性炎癥性氣道疾病的主要病理表現(xiàn)。氣道壁厚度的增加限制了氣道的靈活性和松弛性，從而影響呼吸。目前，對于氣道重塑的潛在調控機制尚不清楚，缺乏有效的預防和治療手段。氣道重塑的病理改變包括氣道平滑肌細胞（ASMCs）肥大或增生、黏液高分泌、上皮下纖維化、上皮下基底膜增厚、血管生成和杯狀細胞化生［14］。ASMCs在氣道炎癥和氣道重塑等氣道病理過程中起著關鍵作用。ASMCs異常增生，可導致氣道壁增厚，促進哮喘患者氣道重塑的發(fā)生［15］。本研究結果證實，小兒止哮平喘顆粒各劑量組較模型組均能明顯降低氣道總管壁面積和氣道平滑肌面積，中、高劑量組與對照組無明顯差異，提示小兒止哮平喘顆粒對于OVA致敏幼齡豚鼠哮喘模型的小氣道重塑具有潛在的改善作用。

小氣道指的是直徑＜2 mm且氣管壁不含有軟骨，從第8級支氣管延伸到末端支氣管的氣道總稱［16］，包括終末細支氣管和呼吸性細支氣管。哮喘患兒的肺實質及大小氣道均存在炎癥改變，而無論哮喘程度如何，均存在小氣道的炎癥，且小氣道的炎癥能反映哮喘的控制情況［17］。在哮喘患者中，50%通氣肺功能檢查可處在正常范圍［18］，90%以上的哮喘患者存在小氣道功能受損［19］，研究證實將小氣道功能改善＞30%作為肺功能舒張試驗陽性指標則可顯著提高兒童哮喘診斷的敏感性［18］。此外，小氣道功能受損與兒童哮喘長期持續(xù)、急性發(fā)作風險、住院率、急診就診率、激素使用率和ICU治療風險等因素顯著有關［18，20］。因此，小氣道功能評價有助于兒童哮喘的診斷和療效的評價。本研究結果證實，小兒止哮平喘顆粒不僅能明顯降低幼齡豚鼠PENH，還能在小氣道炎性細胞浸潤、氣道上皮水腫、管腔狹窄方面都有不同程度的改善，其中高劑量組和對照組幾無明顯差異。提示小兒止哮平喘顆粒對于OVA致敏幼齡豚鼠哮喘模型的小氣道功能具有潛在的改善作用。

本研究結果初步證實小兒止哮平喘顆粒具有改善兒童哮喘小氣道功能障礙和小氣道氣道重塑的潛在功效，但是評價指標并不全面，存在如下問題：1）沒有收集肺泡灌洗液做細胞分類和計數(shù)，未能量化評價氣道炎癥和過敏狀態(tài)水平；2）本研究使用的是無創(chuàng)型肺功能檢查，用PENH反應氣道阻力，這種做法尚存爭議，之后的實驗當使用氣管插管狀態(tài)下的肺功能檢查方法，直接測定氣道阻力、順應性評價氣道高反應性；3）僅從組織病理學染色評價小氣道功能的改善，應當結合肺功能檢查結果，綜合呼出25%、50%、75%肺活量時的呼氣流速結果評價小氣道阻塞和氣流受限情況。之后的研究中將改進實驗方法和檢測指標，以期證明小兒止哮平喘顆粒對兒童哮喘小氣道功能受限和氣道重塑的改善作用，為中醫(yī)藥治療兒童哮喘提供實驗室依據(jù)。