薄 晗 趙曉平 范小璇 于 娟 張夢(mèng)潔 孫 雯

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000）

腦水腫是顱內(nèi)壓增高的主要原因之一，所以控制腦水腫的發(fā)生和發(fā)展是降低顱內(nèi)壓的關(guān)鍵之一［1］。目前臨床多應(yīng)用甘露醇等高滲脫水劑治療腦水腫，但會(huì)影響電解質(zhì)水平及肝腎功能［2］。輕型腦水腫患者日常生活中缺乏相應(yīng)的監(jiān)測(cè)及處置手段，缺乏安全有效的居家保守治療手段，在院治療會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此探索輕型腦水腫居家治療手段可以帶來(lái)明顯的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效益，具有深入探索的意義和價(jià)值。隨著中醫(yī)藥對(duì)腦水腫病因病機(jī)及治療方法的不斷探索，其在輕型腦水腫的居家治療具有一定的實(shí)用價(jià)值。

大黃是唐古特大黃、蓼科植物掌葉大黃的干燥根和根莖，主產(chǎn)于四川，性味苦寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒等功效［3］。本課題組前期通過數(shù)據(jù)挖掘分析中醫(yī)藥治療腦水腫的用藥規(guī)律，可知大黃被廣泛應(yīng)用于腦水腫治療中，因此探索大黃治療腦水腫可能存在的作用機(jī)制及通路，為臨床更好地應(yīng)用中醫(yī)藥治療腦水腫提供啟迪。

1 資料與方法

1.1 大黃活性成分及作用靶點(diǎn)篩選 在TCMSP平臺(tái)（http：//tcmspnw.com/）中檢索大黃活性成分并按照OB%≥30%進(jìn)行篩選，對(duì)篩選得到的大黃活性成分通過DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//go.drugbank.com/）進(jìn)行檢索匹配，得到大黃活性成分及作用靶點(diǎn)信息。運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)信息（https：//www.uniprot.org/）對(duì)作用靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行篩選及統(tǒng)一命名，去除未能與Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)匹配的靶點(diǎn)蛋白。

1.2 大黃成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選得到的大黃活性成分以首字母加數(shù)字的形式進(jìn)行編碼，并與活性成分靶點(diǎn)基因相互組合導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件中構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)自由度值（Dregree）進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，通過節(jié)點(diǎn)面積直接反映Dregree值，間接反映該成分重要性。

1.3 腦水腫疾病靶點(diǎn)獲取 在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.db.idrblab.org/ttd/）及 GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）以“cerebral edema”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到腦水腫的疾病相關(guān)靶點(diǎn)。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)與篩選得到的疾病靶點(diǎn)相匹配，并將疾病靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名，建立疾病靶點(diǎn)基因集備用。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用微生信在線制圖平臺(tái)（https：//www.bioinfor-matics.com.cn/）構(gòu)建大黃活性成分作用靶點(diǎn)與腦水腫疾病靶點(diǎn)veen圖，得到基因靶點(diǎn)公共交集，作為大黃治療腦水腫的潛在核心基因。刪除交集基因重復(fù)項(xiàng)后導(dǎo)入Cytoscape3.8.2中，運(yùn)用Bisogent插件進(jìn)行蛋白相互作用分析，并根據(jù)Betweenness值、Closeness值及Degree值進(jìn)行篩選，如圖1，最終得到存在28個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)及215條互相作用鏈接的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。

圖1 核心靶點(diǎn)篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)制作流程

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因功能注釋及通路富集分析 運(yùn)用Metascape平臺(tái)（https：//metascape.org）對(duì)交集基因分別進(jìn)行 GO BP（Biological Processes）、GO CC（Cellular Components）、GO MF（Molecular Functions）及 KEGG 富集通路分析，并根據(jù)P值及Count值進(jìn)行篩選，得到大黃治療腦水腫的生物過程和信號(hào)通路。應(yīng)用Cytoscape3.8.2構(gòu)建大黃成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，將大黃成分、腦水腫疾病靶點(diǎn)及基因信號(hào)通路的重要性更加數(shù)據(jù)化，從而得出大黃治療腦水腫的核心靶點(diǎn)及主要信號(hào)通路。具體流程見圖2。

圖2 大黃治療腦水腫網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)流程圖

2 結(jié) 果

2.1 大黃活性成分及靶點(diǎn)基因 運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以O(shè)B%≥30%為條件得到30種大黃活性成分，并將其導(dǎo)入Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)匹配靶點(diǎn)蛋白，去除未能匹配成功的活性成分共8項(xiàng)。對(duì)篩選得到的大黃活性成分以首字母加數(shù)字形式進(jìn)行編碼，得到大黃活性成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)表，如表1。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化并為標(biāo)準(zhǔn)基因。將大黃成分及靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape3.8.2繪制大黃成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3，外圈表示大黃活性成分，內(nèi)圈表示活性成分作用靶點(diǎn)基因，并根據(jù)Degree值對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)進(jìn)行可視化表達(dá)。得到大黃活性成分中DLA、beta-sitosterol、aloe-emodin、EUPATIN等成分連接較多的靶點(diǎn)蛋白基因，與PTGS2、PYGS1、HASP90AA1等潛在靶點(diǎn)相互作用較為密切，為進(jìn)一步研究大黃治療腦水腫的作用機(jī)制提供了參考。

圖3 大黃活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 大黃活性成分信息表

2.2 腦水腫疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在GeneCards及TTD中以“cerebral edema”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到腦水腫的疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將兩種數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到的腦水腫的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行合并，刪去重復(fù)項(xiàng)，共得到腦水腫的疾病靶點(diǎn)共1 691項(xiàng)。

2.3 大黃靶點(diǎn)基因與腦水腫疾病靶點(diǎn)匹配 通過大黃活性成分靶點(diǎn)基因與腦水腫疾病靶點(diǎn)基因相匹配得到45個(gè)共同靶點(diǎn)，作為揭示大黃治療腦水腫的潛在基因靶點(diǎn)。

2.4 PPI構(gòu)建及拓?fù)浞治?將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape并通過Bisogent插件對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行分析，共得到4 598個(gè)節(jié)點(diǎn)，117 471條節(jié)點(diǎn)間相互關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)根據(jù)Betweenness值、Closeness值及Degree值進(jìn)行篩選，最終得到28個(gè)核心節(jié)點(diǎn)，215條節(jié)點(diǎn)間連線，如圖4。關(guān)鍵基因靶點(diǎn)包含HSP90AA1、APP、ESR1、CUL3、HSP90AB1、XPO1、EGFR、MCM2、MYC、UBC等。并進(jìn)一步利用MCODE插件篩選關(guān)鍵基因子板塊，其中包括23個(gè)節(jié)點(diǎn)，70條節(jié)點(diǎn)間連線，見表2。

圖4 蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 MCODE網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果

2.5 GO分析與KEGG通路分析 將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺(tái)進(jìn)行GO分析與KEGG通路分析。分析結(jié)果顯示大黃治療腦水腫核心靶點(diǎn)基因主要涉及神經(jīng)遞質(zhì)的代謝過程、對(duì)有毒物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)、調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡和對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)等生物過程；影響細(xì)胞膜、胞質(zhì)囊腔、線粒體膜、核質(zhì)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以及影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、參與凋亡信號(hào)通路、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等分子功能，見圖5。KEGG結(jié)果涉及癌癥蛋白多糖通路、雌激素信號(hào)通路、乙肝病毒信號(hào)通路等，見圖6。根據(jù)富集分?jǐn)?shù)篩選前10條KEGG通路及其相關(guān)基因信息，見表3。

表3 前10條KEGG通路分析表

圖5 大黃治療腦水腫核心靶點(diǎn)GO分析

圖6 大黃治療腦水腫潛在核心靶點(diǎn)KEGG分析

3 討 論

腦水腫屬于中醫(yī)學(xué)中風(fēng)范疇，張仲景在《金匱要略》中提出“血不利則為水”［4］，道出了顱腦血運(yùn)不利，旁溢為水而發(fā)為腦水腫的病機(jī)。明代醫(yī)家王肯堂在《證治準(zhǔn)繩》中提出了“瘀于腦府”“瘀則成水”理論。國(guó)醫(yī)大師張學(xué)文教授提出腦水腫多為“顱腦水瘀”證，認(rèn)為氣血運(yùn)行不暢，導(dǎo)致瘀血內(nèi)留，水津內(nèi)生，水瘀互結(jié)于顱內(nèi)而致腦失所養(yǎng)，神機(jī)不運(yùn)，變證從生［5］。中醫(yī)治療腦水腫多運(yùn)用活血化瘀、利水滲濕、涼血通瘀、活血通絡(luò)等多種治法均取得較好的療效。

通過綜合分析大黃主要活性成分與腦水腫疾病靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)沒食子酸、乳酸、大黃酸、β-谷甾醇、蘆薈大黃素為較為關(guān)鍵的化合物成分。沒食子酸可擴(kuò)張血管和抑制血小板聚集，同時(shí)具有抗氧化作用，可通過生物膜的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)時(shí)提供電子產(chǎn)生清除自由基的作用，從而減輕腦組織的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制腦水腫的形成［6］。大黃酸是大黃主要活性成分，具有抑菌、抗炎及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用［7］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大黃酸可以逆轉(zhuǎn)AQP4的過度表達(dá)，并能夠通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而阻礙炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制神經(jīng)炎癥，機(jī)制可能與Nrf2/Src/MAPKs通路相關(guān)［8］。β-谷甾醇具有抗炎、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等方面的作用，其改善腦組織含水量，降低腦水腫程度機(jī)制可能與提高抗炎因子IL-10活性、抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、增加Th-1型淋巴細(xì)胞及改變細(xì)胞膜的流行性等方面相關(guān)［9-11］。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，大黃治療腦水腫的核心靶點(diǎn)主要有：HSP90AA1、APP、ESR1、EGFR、CUL3、HSP90AB1、XPO1、MCM2、MYC、UBC、FN1、COPS5、CDK2、GRB2等。HSP90AA1廣泛分布于腦、脊髓、神經(jīng)元等組織中，參與細(xì)胞周期控制和信號(hào)傳導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)HSP90AA1抑制下游凋亡蛋白Caspase-9的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，增加一氧化氮合成酶生成從而發(fā)揮抗凋亡作用，減輕腦缺血鈷灌注損傷，減輕腦水腫程度［12］。APP是一種集中分布于神經(jīng)元突觸的膜內(nèi)在蛋白，可以被α-、β-、γ-蛋白酶分解產(chǎn)生Aβ從而導(dǎo)致腦內(nèi)老年斑形成和神經(jīng)細(xì)胞凋亡［13］。Bugiani O等發(fā)現(xiàn)抑制APP表達(dá)可減少腦出血等腦水腫原發(fā)疾病發(fā)生率［14］。ESR1可影響細(xì)胞增殖與分化，減少NF-kappa-B DNA結(jié)合活性，是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，抑制組織炎癥反應(yīng)，降低水腫發(fā)生率［15］。EGFR是上皮生長(zhǎng)因子細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體，與血管生成、腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和細(xì)胞凋亡有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)EGFR可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，加速膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡從而減輕瘤周水腫，降低腦水腫程度［16］。綜上，大黃可能通過調(diào)節(jié)多種核心蛋白表達(dá)從而達(dá)到治療或減輕腦水腫的目的。

通過對(duì)大黃活性成分靶點(diǎn)與腦水腫疾病靶點(diǎn)共同基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，共同基因靶點(diǎn)的生物進(jìn)程富集主要涉及皮質(zhì)類固醇反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、神經(jīng)元凋亡進(jìn)程調(diào)控和抗氧化等方面；細(xì)胞結(jié)構(gòu)主要涉及線粒體包膜、突觸后膜、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等；分子功能富集主要涉及半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合、鈣調(diào)蛋白結(jié)合、熱休克蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合等方面。腦水腫是腦組織受損后產(chǎn)生的主要病理變化，其機(jī)制主要涉及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)導(dǎo)致的氧自由基損傷血腦屏障后出現(xiàn)的神經(jīng)細(xì)胞損害；炎癥因子、腫瘤壞死因子等損傷腦血管［17］。對(duì)共同靶點(diǎn)基因的功能富集分析中得到的諸多通路均直接或間接參與腦組織損傷后腦水腫形成過程，提示大黃治療腦水腫可能通過多靶點(diǎn)共同作用實(shí)現(xiàn)。對(duì)共同基因靶點(diǎn)的KEGG通路富集進(jìn)行分析后得出：大黃治療腦水腫的關(guān)鍵通路主要涉及腫瘤中的蛋白多糖通路、雌激素信號(hào)通路等。蛋白多糖通路主要涉及腦組織細(xì)胞缺血缺氧后損傷機(jī)制，其抗體可減少炎性細(xì)胞對(duì)腦組織浸潤(rùn)，其進(jìn)程與GM-CSF及ERK2的表達(dá)存在聯(lián)系［18］。雌激素信號(hào)通路主要通過拮抗興奮性氨基酸而起到保護(hù)腦神經(jīng)的作用。Chen等發(fā)現(xiàn)雌激素分泌增加可降低腦出血后組織亞鐵含量，增強(qiáng)腦組織中硫氧還蛋白（Trx）活性從而減輕出血后對(duì)腦組織產(chǎn)生的損傷，減輕腦水腫程度［19］。Behl等發(fā)現(xiàn)雌激素分泌可拮抗神經(jīng)細(xì)胞氧化，機(jī)制可能與降低谷氨酸鹽、過氧化氫等對(duì)海馬細(xì)胞的毒性作用相關(guān)［20］?；趯?duì)共同靶點(diǎn)的通路分析得出大黃治療或減輕腦水腫可能是通過多種途徑綜合實(shí)現(xiàn)，但具體的信號(hào)通路在治療過程中發(fā)揮的作用還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。