王如琪 張洋洋 楊潔紅 何 昱 丁志山 萬海同 虞 立

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

腦血管疾病是臨床上常見的一類神經(jīng)系統(tǒng)疾病，60%～80%為缺血性腦血管疾?。?］。腦缺血是由于血管堵塞造成的腦血流量減少，腦缺血時(shí)間越長，腦損傷越嚴(yán)重。一方面，缺血再灌注能夠挽救缺血半暗帶內(nèi)瀕死的細(xì)胞；另一方面，再灌注后由于各種原因會使神經(jīng)細(xì)胞加重?fù)p傷以致死亡，引發(fā)腦缺血再灌注損傷。因此，在腦缺血的治療中，防止再灌注損傷顯得尤為重要。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，炎癥反應(yīng)起著關(guān)鍵性作用，尤以NLRP3炎性小體最為重要。腦缺血后會誘導(dǎo)NLRP3的表達(dá)和活化，激活白細(xì)胞介素-18（IL-18）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），三者相互影響、相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)炎癥以及細(xì)胞毒性。此外，腦缺血還會導(dǎo)致STAT3磷酸化，引發(fā)神經(jīng)元凋亡，加重腦損傷等。養(yǎng)陰通腦顆粒是現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，具有抗氧化、抗炎、抗血栓、增加腦血流量、改善微循環(huán)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用［2-3］。本實(shí)驗(yàn)采用改良線栓法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察養(yǎng)陰通腦顆粒對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，以期為心腦血管等疾病方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（280±20）g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物質(zhì)量許可證號：SCXK（浙）2018-0012。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物學(xué)科評審委員會批準(zhǔn)。

1.2 試藥與儀器 養(yǎng)陰通腦顆粒（藥物組成：生地黃、黃芪、葛根、川芎等，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)心腦血管病研究所自主研發(fā)［4］，華東醫(yī)藥股份有限公司提供顆粒劑）。氯化三苯四氮唑（TTC，南京建成科技有限公司，批號：BCCB1241）；IL-18檢測試劑盒（江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，貨號：MB-1735A）；TNF-α檢測試劑盒（江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，貨號：MB-1721A）；DEPCH2O（上海捷瑞生物工程有限公司，批號：2006G15）；總RNA提取試劑盒（美國英杰生命技術(shù)有限公司，批號：223306）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海佰曄生物科技中心，貨號：G490）；引物（上海生工生物科技有限公司）。酶標(biāo)儀（美國 MD SpectraMax Plus384）；Sigma 2-16PK離心機(jī)（Sigma公司）；QuantStudio 3定量PCR儀（美國ABI）；微量核酸蛋白分析儀（美國熱電）。

1.3 模型制備 采用Longa等［5］的改良線栓法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型。手術(shù)前12 h禁食不禁水，用10%的水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠。仰臥位固定大鼠，腹面向上，剃毛器剔除頸部毛發(fā)并用酒精棉球擦拭消毒，用剪刀在頸部正中位置切一小口，分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，然后用絲線結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈根部，用微型動脈夾夾住頸內(nèi)動脈，在頸總動脈近分叉部剪一小口，將線栓的圓頭端自切口推入，打開動脈夾，至線栓黑色標(biāo)記到達(dá)三叉口處停下。此時(shí)，大鼠腦中動脈起始端的供血已被完全阻斷，腦缺血模型制備成功，1 h后，輕輕拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組除不插入線栓外，其余同模型組。判斷模型成功的標(biāo)志為蘇醒后大鼠右眼呈現(xiàn)Horner征，提尾時(shí)出現(xiàn)左前肢內(nèi)收屈曲，行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒，且取材時(shí)未發(fā)現(xiàn)顱底出血。

1.4 分組與給藥 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、養(yǎng)陰通腦顆粒組。將養(yǎng)陰通腦顆粒用生理鹽水溶解，配成混懸液，按1.73 g/（kg·d）灌胃給藥，假手術(shù)組與模型組灌胃等量生理鹽水。各組每日給藥1次，連續(xù)3 d。

1.5 神經(jīng)功能評分 建立模型后24、48、72 h采用Longa5級4分法［6］對大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評分。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀。1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，即提尾時(shí)對側(cè)前肢內(nèi)收屈曲，不能完全伸展對側(cè)前肢。2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走困難并向?qū)?cè)傾倒。4分：意識水平下降，無法自發(fā)行走。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）腦梗死體積比。給藥結(jié)束后斷頭取腦，將腦組織放置在-20℃冰箱中冷凍約15 min，以2 mm厚度切取冠狀組織6片，然后置于2%TTC溶液中，37℃下孵育30 min染色至顯色完全，正常的腦組織被染為深紅色，梗死的區(qū)域顯示為灰白色。最后將腦切片按順序排列整齊，用數(shù)碼相機(jī)拍照，通過圖像分析軟件Image計(jì)算梗死體積比。2）RT-PCR法檢測NLRP3、STAT3。取大鼠腦組織，分離缺血側(cè)半腦，用總RNA提取試劑盒提取腦組織勻漿中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說明書操作。引物序列如下：NLRP3 正向：5′-ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3′，反向：5′-AACCAATGCGAGATCCTGAC-3′；STAT3正向：5′-AATATAGCCGATTCCTGCAAGAG-3′，反 向 ：5′-TGGCTTCTCAAGATACCTGCTC-3′；GAPDH 正向：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′；反 向 ：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。分析各組mRNA含量采用 2-ΔΔCt法，參比基因?yàn)?GADPH。3）ELISA 法檢測IL-18、TNF-α水平。采集血漿，4℃下4 000 r/min離心10 min，取上層，按照試劑盒說明書分別對IL-18、TNF-α進(jìn)行測定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組Longa評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，養(yǎng)陰通腦顆粒組能明顯減輕大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀（P＜0.01）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（分，±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

72 h 0 2.33±0.52**0.67±0.52△△組別假手術(shù)組模型組養(yǎng)陰通腦顆粒組n 12 12 12 24 h 0 2.50±0.55**1.67±0.52△△48 h 0 2.67±0.52**1.17±0.75△△

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較 經(jīng)TTC染色后，正常腦組織呈深紅色，梗死區(qū)域呈灰白色，各組TTC染色比較見圖1。模型組腦梗死體積比為（0.36±0.05），與假手術(shù)組比較顯著增加（P＜0.01）；養(yǎng)陰通腦顆粒組腦梗死體積比為（0.18±0.03），與模型組相比明顯減少（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠腦梗死組織TTC染色

2.3 各組大鼠腦組織NLRP3、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組NLRP3、STAT3 mRNA水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，養(yǎng)陰通腦顆粒組NLRP3、STAT3 mRNA水平顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦組織NLRP3、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織NLRP3、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組養(yǎng)陰通腦顆粒組n 12 12 12 NLPR3 mRNA 0.63±0.55 5.67±1.38*1.70±0.68△STAT3 mRNA 1.00±0.12 3.67±1.38*1.87±0.40△

2.4 各組大鼠血漿IL-18、TNF-α水平比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組IL-18、TNF-α水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，養(yǎng)陰通腦顆粒組IL-18、TNF-α水平顯著降低（P＜0.01）。

表3 各組大鼠血漿IL-18、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血漿IL-18、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

組別假手術(shù)組模型組養(yǎng)陰通腦顆粒組n 12 12 12 IL-18 145.73±4.54 167.32±6.98**155.40±1.46△△TNF-α 217.89±10.53 262.05±3.53**242.65±7.71△△

3 討 論

腦缺血再灌注損傷屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率，嚴(yán)重威脅人類健康，血瘀氣虛則是其發(fā)病的關(guān)鍵。研究表明，血瘀、氣虛與炎癥損傷密切相關(guān)。對于缺血性中風(fēng)多采用活血益氣法，而養(yǎng)陰通腦顆粒具有養(yǎng)陰益氣、活血化瘀的功效。故本實(shí)驗(yàn)研究了養(yǎng)陰通腦顆粒對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

神經(jīng)炎癥在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著關(guān)鍵性作用，當(dāng)腦部促炎和抗炎細(xì)胞因子處于平衡狀態(tài)時(shí)，可極大地促進(jìn)腦損傷后受損組織的修復(fù)，但是當(dāng)炎癥反應(yīng)過度時(shí)，則會引起繼發(fā)性損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡等［7］。腦缺血會激活固有免疫系統(tǒng)，小膠質(zhì)細(xì)胞活化并釋放大量炎癥因子，引起腦組織繼發(fā)性損傷，其中NLRP3炎性小體作為炎癥反應(yīng)的核心，在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中發(fā)揮了重要作用［8-9］。腦缺血會誘導(dǎo)NLRP3的表達(dá)增加和活化，使其活化的產(chǎn)物IL-18、IL-1β和Caspase-1水平升高，加重血腦屏障損傷、炎癥反應(yīng)和缺血損傷［10-12］。本研究表明，養(yǎng)陰通腦顆粒能降低NLRP3炎性小體的表達(dá)和活化水平，發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷作用。

大鼠腦缺血再灌注損傷后，IL-18和TNF-α被強(qiáng)烈激活，導(dǎo)致局灶的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)的擴(kuò)散［13］。TNF-α能干擾大腦的正常功能，激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，影響血腦屏障的通透性［14］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，IL-18主要由小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，能以自分泌和旁分泌的形式增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞中Caspase-1的表達(dá)，并誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子TNF-α的分泌。此外，IL-18還會導(dǎo)致多形核白細(xì)胞（PMN）的呼吸爆發(fā)和脫粒，引起神經(jīng)毒性酶的釋放，經(jīng)單核細(xì)胞分泌的干擾素-g（IFN-g）刺激，還會釋放出活性氧（ROS），進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)炎癥和細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，養(yǎng)陰通腦顆粒組能夠顯著降低腦缺血再灌注損傷腦組織中IL-18和TNF-α的表達(dá)水平，有效抑制腦缺血后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

最近的研究表明，STAT3在腦卒中后的血管生成方面起著重要的作用。腦缺血損傷會導(dǎo)致STAT3磷酸化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，磷酸化的STAT3增多則會引起神經(jīng)元的凋亡增多［15］。此外，STAT3還參與了小膠質(zhì)、巨噬細(xì)胞的形態(tài)分型，抑制STAT3可使小膠質(zhì)細(xì)胞靜止并促使M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，發(fā)揮更有效的抗炎作用［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，養(yǎng)陰通腦顆粒能降低腦組織中STAT3的含量，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，保護(hù)腦組織免受缺血/再灌注損傷。

綜上，養(yǎng)陰通腦顆?？蓽p少神經(jīng)功能損傷，減小腦梗死體積，降低NLRP3、STAT3、IL-18、TNF-α的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)為研究養(yǎng)陰通腦顆粒對腦缺血再灌注損傷的炎癥保護(hù)作用提供了參考，并為其在心腦血管等疾病方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。