孫新，張蕙雯，孫立新，劉軍，遇瓏，孫力超，冉宇靚（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，國(guó)家癌癥中心國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

胃癌的發(fā)病率位居世界第五，為第三大致命癌癥[1]；全球每年約有100 萬新增病例和60 萬病死病例[2-3]。由于胃癌具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移性、侵襲性、化療耐藥性，導(dǎo)致胃癌患者的5 年生存率不到30%[4]。胃癌干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素之一[5]。TAKAISH等[6]在2009年首次在胃癌細(xì)胞系中成功分離并鑒定出胃上皮細(xì)胞來源的胃癌干細(xì)胞。隨后的一系列研究表明，胃癌干細(xì)胞具有不斷自我更新和多向分化的潛能，與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]，更是引起胃癌細(xì)胞侵襲性、耐藥性和轉(zhuǎn)移性的關(guān)鍵原因[8-11]。因此，針對(duì)胃癌干細(xì)胞進(jìn)行的靶向治療對(duì)胃癌患者的臨床治療具有重要意義。據(jù)已有的研究結(jié)果[12-14]表明，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，不同亞群的腫瘤干細(xì)胞在各自的惡性表型中發(fā)揮作用，且腫瘤干細(xì)胞的不同亞群之間具有可塑性，不同的腫瘤干細(xì)胞亞群可進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化從而降低其受到的藥物抑制效果，因此，針對(duì)胃癌干細(xì)胞進(jìn)行靶向治療需要同時(shí)關(guān)注不同亞群胃癌干細(xì)胞在治療前后的變化和影響，才能更有效地通過抑制胃癌干細(xì)胞來達(dá)到協(xié)同化療提高胃癌治療效果的目的。

HSP90是一種高度保守的應(yīng)激性分子伴侶蛋白，其在多種腫瘤中高表達(dá)，可存在于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外及胞膜上，且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[15-18]。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，腫瘤患者血清中HSP90的表達(dá)顯著上升，并與不良預(yù)后相關(guān)，顯示血清HSP90 的含量可以作為腫瘤診斷中的一個(gè)參考指標(biāo)[19-21]；并同時(shí)提示了eHSP90 可能在腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、抵抗化療中發(fā)揮了關(guān)鍵的促進(jìn)作用[22-24]。在乳腺癌[25]、前列腺癌[24-26]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[27]中的研究均提示處理eHSP90+細(xì)胞有顯著的干細(xì)胞特性。eHSP90可能具有作為胃癌治療中針對(duì)胃癌干細(xì)胞靶向治療的新靶點(diǎn)的巨大潛力，但目前特異靶向eHSP90的研究較少，相關(guān)機(jī)制還不清楚。因此本研究將嘗試通過前期制備的一株HSP90 單克隆抗體28C10 靶向處理eHSP90，探討其對(duì)胃癌干細(xì)胞的作用和機(jī)制，以期該抗體能協(xié)同化療顯著提高療效，從而探索胃癌精準(zhǔn)靶向聯(lián)合治療的新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌PAMC82 細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，抗HSP90 抗體為本課題組實(shí)驗(yàn)篩選得到的特異性識(shí)別HSP90的雜交瘤單抗28C10。AldefluorTM檢測(cè)試劑盒購(gòu)于加拿大Stem cell Technologies 公司，F(xiàn)ITC-CD44 抗體購(gòu)于eBioscience 公司，抗體ab13492、ab115641、ab51037均購(gòu)于Abcam 公司，抗體2890S、4900S、4249S、4228S、2920S、4060S、2983S、5536S 均購(gòu)于CST 公司?？贵w10162R 購(gòu)于博奧森公司，基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD 公司，Transwell 小室購(gòu)于美國(guó)Millipore 公司，0.1%結(jié)晶紫溶液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，甲基纖維素購(gòu)于Sigma 公司，CCK-8 試劑購(gòu)于日本同仁化學(xué)所，bFGF、B27、EGF均購(gòu)于Invitrogen公司。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)與免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)HSP90在PAMC82細(xì)胞中的表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PAMC82 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，將1 μg 一抗ab115641加入1 mL細(xì)胞懸液中，室溫避光處理30 min，離心清洗3次，以500μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PAMC82 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至7.5×104個(gè)/mL，以200 μL/孔接種于鋪好爬片的24孔板（1.5×104個(gè)/孔），實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各一板，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組加200μL/孔的一抗ab13492（1∶200 稀釋），置于37 ℃、5% CO2孵箱中2 h。對(duì)照組加200μL/孔的PBS，置于4 ℃冰箱中2 h。加入5%BSA 37 ℃處理30 min，加入甲醛（提前拿到室溫）200 μL/孔，室溫固定15min，PBS洗滌3 min×3次，0.2% TritonX-100（現(xiàn)配：200 μL+100 mL PBS）200 μL/孔透化15 min，PBS 洗滌3 min×3 次，羊抗鼠熒光二抗488（1∶200 稀釋）200 μL/孔室溫避光40 min，PBST 洗滌3 min×3 次（現(xiàn)配），PBS洗 滌3 min×3 次，DIPA 封片，室溫放置10 min，共聚焦顯微鏡觀察并拍照?；罴?xì)胞免疫熒光eHSP90染色在細(xì)胞固定打孔前完成。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PAMC82 細(xì)胞中eHSP90+分別與ALDH+、CD44+亞群共染情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PAMC82 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)密度至1×106個(gè)/mL，對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行ALDH+亞群和eHSP90+亞群共染、CD44+亞群和eHSP90+亞群共染，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。

1.4 無血清成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)28C10對(duì)PAMC82細(xì)胞自我更新能力的影響

2 mL 0.8%甲基纖維素培養(yǎng)基加入低黏附24 孔板，實(shí)驗(yàn)設(shè)DDP（0.5 μg/mL）組、28C10（40 μg/mL）組、DDP（0.5 μg/mL）+28C10（40 μg/mL）組和PBS 對(duì)照組，各自作用4 d后，細(xì)胞均調(diào)為5×104個(gè)（10μL）/孔的無血清單細(xì)胞懸液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)7 d 后觀察計(jì)數(shù)成球情況，并在倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)28C10對(duì)PAMC82細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

4 組細(xì)胞藥物作用4 d 后，將細(xì)胞制成無血清單細(xì)胞懸液，調(diào)密度至2.5×105個(gè)/mL。遷移實(shí)驗(yàn)上室加200 μL 無血清單細(xì)胞懸液，下室加650 μL 相應(yīng)的10%完全培養(yǎng)基。侵襲實(shí)驗(yàn)提前將基質(zhì)膠于4 ℃溶化，將槍頭、Transwell 小室于-20 ℃預(yù)冷后在每小室上室加入100μL 10%基質(zhì)膠（基質(zhì)膠∶無雙抗培養(yǎng)基為1∶9），37 ℃、5%CO2放置1～2 h，吸出多余基質(zhì)膠晾干，其余操作同遷移實(shí)驗(yàn)。于37 ℃、5%CO2孵箱中遷移實(shí)驗(yàn)放置24 h、侵襲實(shí)驗(yàn)放置30 h后固定細(xì)胞并染色，切下小室于載玻片上用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并拍照。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)28C10對(duì)PAMC82細(xì)胞克隆形成能力的影響

4 組細(xì)胞藥物各自作用4 d 后，將細(xì)胞制成無血清單細(xì)胞懸液，調(diào)密度至5×104個(gè)/mL，100 mm 培養(yǎng)皿中加入10 μL（500 個(gè)細(xì)胞）細(xì)胞懸液，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)2～3 周后出現(xiàn)肉眼可見單克隆，加入2 mL 4% 多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS洗2 次，加入2 mL 0.1% 晶紫染色30 min，蒸餾水洗2次，晾干，統(tǒng)計(jì)每組細(xì)胞克隆數(shù)并拍照。

1.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)28C10和DDP單獨(dú)與聯(lián)合處理對(duì)PAMC82細(xì)胞存活率及增殖能力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PAMC82 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)密度至2.5×104/mL，按200μL/孔接種于96孔板，上述4組每組設(shè)3個(gè)平行孔。取4組分別在藥物作用的0、24、48、72 h 時(shí)間點(diǎn)加入CCK-8 試劑，2 h 后在波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)定光密度（D）值。設(shè)定對(duì)照組的存活率為100%，計(jì)算其他3組細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)存活率，分析28C10 對(duì)DDP 的協(xié)同化療作用，繪制不同組別的協(xié)同抑制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.8 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)28C10和DDP單獨(dú)與聯(lián)合處理對(duì)PAMC82細(xì)胞惡性潛能的抑制

同1.7方法接種細(xì)胞至96孔板，每組設(shè)3個(gè)平行孔，各組藥物處理72 h,加CCK-8試劑2 h后分別測(cè)處理0、24、48、72、96 h時(shí)細(xì)胞在波長(zhǎng)450 nm下的D值。

1.9 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PAMC82細(xì)胞經(jīng)28C10處理后對(duì)順鉑耐藥性變化

同1.7方法接種細(xì)胞至96孔板中，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)12 h，分別設(shè)0.05、0.1、0.5、1、5μg/mL DDP單獨(dú)組及與28C10（40μg/mL）聯(lián)合組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞至80%匯合度時(shí)，吸出原培養(yǎng)基，加入10%CCK-8試劑（100μL/孔），2 h后在波長(zhǎng)450 nm下測(cè)定D值，繪制各組細(xì)胞的耐藥曲線并計(jì)算DDP的IC50值。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)28C10 對(duì)PAMC82 細(xì)胞干性表型的影響

28C10 處理4 d 后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PAMC82 細(xì)胞制成2×105個(gè)/mL 單細(xì)胞懸液，每組兩管分別為“CON”、“test”。將細(xì)胞懸液1 mL加到“test”管，加5μL DEAB 試劑到“CON”管中，立即蓋蓋。在“test”管中加入5 μL 活化的ALDEFLUORTM試劑，混勻后立即將500 μL 混合物轉(zhuǎn)移至“CON”管中。將“CON”、“test”管放入37 ℃、5% CO2孵箱中45 min，取出兩試管離心5 min，棄上清，用分析緩沖液500μL重懸，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。

1.11 WB法檢測(cè)28C10對(duì)PAMC82細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

取28C10 處理4 d 后的PAMC82 細(xì)胞，對(duì)PAMC82細(xì)胞進(jìn)行無血清低黏附培養(yǎng)，收集富含腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞球，將其細(xì)胞裂解并提取總蛋白，用SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后次日TBST 洗膜4次，每次8 min。分別加入一抗（OCT4 單抗2890S 以1∶1 000 稀釋；SOX2 單抗4900S 以1∶1 000 稀釋；ALDH 單抗10162R 以1∶300 稀釋；CD44 單抗ab51037 以1∶1 000 稀釋）及其對(duì)應(yīng)的二抗[SOX2、ALDH：過氧化物酶結(jié)合親和純山羊抗小鼠IgG Fc以1∶5 000 稀釋；CD44、OCT4：過氧化物酶結(jié)合親和純山羊抗兔IgG（H+L）以1∶5 000 稀釋]，室溫放置1 h，TBST 洗膜4 次、每次8 min，顯色。信號(hào)通路WB 檢測(cè)同上，一抗PI3K 單抗4249S以1∶1 000稀釋，p-PI3K單抗4228S 以1∶1 000 稀釋，AKT 單 抗2920S 以1∶2 000 稀釋，p-AKT 單抗4060S 以1∶2 000 稀釋，mTOR單抗2983S以1∶1 000稀釋，p-mTor單抗5536S以1∶1 000 稀釋；對(duì)應(yīng)的二抗為AKT：過氧化物酶結(jié)合親和純山羊抗小鼠IgG Fc 以1∶5 000 稀釋，PI3K、p-PI3K、p-AKT、mTOR、p-mTOR 過氧化物酶結(jié)合親和純山羊抗兔IgG（H+L）以1∶5 000稀釋。

1.12 免疫熒光法檢測(cè)28C10作用前后eHSP90亞細(xì)胞定位變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PAMC82 細(xì)胞制成7.5×104個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，24孔板中提前放入匹配的爬片，每孔加入200μL 細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)組加入28C10（40μg/mL）后，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)2 h；對(duì)照組加等量PBS 后，4 ℃培養(yǎng)2 h。后續(xù)操作同1.2 中固定細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.2～1.11 實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用F檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞PAMC82中HSP90的表達(dá)情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖1A）顯示，在PAMC82細(xì)胞中有（2.502±0.013）%的eHSP90+亞群細(xì)胞。固定細(xì)胞免疫熒光顯示，PAMC82細(xì)胞膜上可見微量HSP90，而胞質(zhì)中有大量HSP90染色且染色均勻，呈正常的胞質(zhì)蛋白染色特征（圖1B）；活細(xì)胞免疫熒光（圖1C）顯示，PAMC82 細(xì)胞膜上及鄰近膜局部有呈顆粒狀的HSP90染色，呈繞核分布狀態(tài)，也可見少量靠核染色，呈膜蛋白初步內(nèi)化后的染色特征，但染色特征依然與固定細(xì)胞胞質(zhì)蛋白染色的特征模式（圖1B）有明顯差別，表明PAMC82細(xì)胞膜上確實(shí)存在eHSP90。

圖1 PAMC82細(xì)胞中HSP90的表達(dá)情況

2.2 PAMC82細(xì)胞中ALDH+、CD44+亞群的比例及其各自與HSP90+共陽(yáng)性細(xì)胞比例

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（圖2）顯示，PAMC82 細(xì)胞中有（3.08±0.07）%ALDH+細(xì)胞（圖2A），有（4.84±0.07）%CD44+細(xì)胞（圖2B）。ALDH+與HSP90+共染細(xì)胞比例為（31.24±0.62）%，即HSP90+細(xì)胞中約有31%ALDH+細(xì)胞；CD44+與HSP90+共染比例為（46.68±0.89）%，即HSP90+細(xì)胞中約有47% CD44+細(xì)胞（圖2C）。由于ALDH+、CD44+細(xì)胞被認(rèn)為代表兩種不同的胃癌腫瘤干細(xì)胞亞群，而ALDH+、CD44+又分別可與HSP90+細(xì)胞共染，所以上述結(jié)果證明細(xì)胞膜上高表達(dá)的eHSP90可能也可作為腫瘤干性相關(guān)標(biāo)志物。

圖2 PAMC82細(xì)胞中ALDH+、CD44+及其兩者分別與HSP90共陽(yáng)性細(xì)胞的比例

2.3 28C10 明顯抑制PAMC82 細(xì)胞的干性及相關(guān)特性并提高DDP的抑癌效果

經(jīng)28C10處理后，PAMC82細(xì)胞成球能力明顯減少（P＜0.01，圖3A），與DDP 聯(lián)合處理后減少更明顯（P＜0.01,圖3A）；PAMC82細(xì)胞的遷移、侵襲和克隆形成能力在28C10處理后明顯降低（P＜0.01，圖3B、C），在28C10 和DDP 聯(lián)合處理后降低更為明顯（P＜0.01，圖3B、C）。結(jié)果表明，28C10 可顯著抑制胃癌細(xì)胞PAMC82 的自我更新、遷移侵襲和增殖能力，與DDP聯(lián)合后顯著協(xié)同抑制PAMC82 的自我更新和增殖潛能。將兩藥聯(lián)合直接持續(xù)處理PAMC82 細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，DDP＋28C10聯(lián)合治療能顯著抑制細(xì)胞增殖能力（P＜0.05 或P＜0.01，圖3D）。進(jìn)一步采用兩藥聯(lián)合處理72 h 后撤藥，發(fā)現(xiàn)DDP+28C10 聯(lián)合治療顯著抑制細(xì)胞增殖潛能的時(shí)間持續(xù)至96 h（P＜0.05 或P＜0.01，圖3E）。以上結(jié)果表明，28C10 可以使PAMC82 細(xì)胞干性相關(guān)功能下降，不僅可協(xié)同DDP 抑制胃癌細(xì)胞增殖，還可在停藥后持續(xù)地抑制細(xì)胞的惡性增殖潛能。

圖3 28C10和DDP單獨(dú)或兩者聯(lián)合處理對(duì)PAMC82細(xì)胞干性功能的影響

2.4 28C10 與DDP 協(xié)同處理顯著提高胃癌細(xì)胞PAMC82對(duì)DDP的敏感性

連續(xù)用藥48 h后檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以CON組存活率為100%作為參照，DDP組存活率為（83.8±1.26）%、28C10 組存活率為（91.60±0.56）%；DDP+28C10 組存活率為（68.50±0.84）%（P＜0.05 或P＜0.01，圖4A）。藥敏曲線顯示，28C10（40 μg/mL）的協(xié)同作用可將DDP 對(duì)PAMC82 細(xì)胞的IC50由0.470 μg/mL大幅下降至0.049μg/mL（P＜0.05，圖4B）。結(jié)果表明，28C10可顯著增敏化療，協(xié)同DDP提高治療效果。

圖4 28C10與DDP聯(lián)合處理提高胃癌細(xì)胞PAMC82對(duì)DDP的敏感性

2.5 28C10 處理后胃癌細(xì)胞PAMC82 干性相關(guān)蛋白表達(dá)和干性表型細(xì)胞數(shù)量均下降

28C10（40μg/mL）作用4 d后，將對(duì)PAMC82細(xì)胞進(jìn)行無血清低黏附培養(yǎng),收集富含腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞球，提取蛋白后進(jìn)行WB 分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，細(xì)胞中干性相關(guān)蛋白OCT4、SOX2 表達(dá)量明顯下降（P＜0.05或P＜0.01，圖5A），干性標(biāo)志物ALDH、CD44表達(dá)量也明顯下降（P＜0.05或P＜0.01，圖5B）。28C10作用4 d后對(duì)PAMC82 細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示，ALDH+細(xì)胞[CON組為（3.08±0.073）%，28C10組為（1.40±0.017）%；P＜0.01]、CD44+細(xì)胞[CON 組為（4.84±0.067）%，28C10組為（1.37±0.032）%；P＜0.01]數(shù)量均顯著下降（圖5C）。結(jié)果說明，28C10可同時(shí)靶向抑制PAMC82細(xì)胞ALDH+、CD44+胃癌干細(xì)胞亞群，抗eHSP90處理可以使PAMC82細(xì)胞干性相關(guān)蛋白表達(dá)下降、干性表型細(xì)胞數(shù)量也下降。

圖5 28C10處理對(duì)PAMC82干性相關(guān)蛋白表達(dá)和細(xì)胞干性表型的影響

2.6 28C10 作用后PAMC82 細(xì)胞的eHSP90+表型變化及其內(nèi)化情況

28C10（40 μg/mL）作 用PAMC82 細(xì) 胞4 d 后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖6A）顯示，eHSP90+細(xì)胞比例顯著下降[CON 組為（2.96±0.49）%，28C10組為（1.36±0.55）%；P＜0.01]，與ALDH+、CD44+細(xì)胞亞群比例的變化一致，提示28C10可能通過影響eHSP90+細(xì)胞而導(dǎo)致ALDH+、CD44+亞群變化。在28C10作用2 h 后，使用免疫熒光染色共聚焦實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PAMC82細(xì)胞膜上eHSP90是否內(nèi)化，結(jié)果可觀察到活細(xì)胞狀態(tài)下加入28C10，一開始僅結(jié)合細(xì)胞膜上的eHSP90，在作用一段時(shí)間后可與溶酶體標(biāo)志物L(fēng)AMP在細(xì)胞質(zhì)中共定位，表明eHSP90 與28C10 結(jié)合后可發(fā)生內(nèi)化（圖6B）。WB法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示，PAMC82富含干細(xì)胞的亞群中總HSP90 表達(dá)量也相應(yīng)地明顯下降，相對(duì)表達(dá)量由（0.45±0.09）降至（0.27±0.06）（P＜0.01，圖6C）。結(jié)合前述免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，提示28C10 作用導(dǎo)致內(nèi)化的eHSP90 可能已被降解，從而使PAMC82 細(xì)胞中總HSP90 表達(dá)量和eHSP90+細(xì)胞亞群均下降。

圖6 28C10作用后PAMC82細(xì)胞的eHSP90+細(xì)胞數(shù)量變化及eHSP90內(nèi)化情況

2.7 28C10 通過抑制PI3K/AKT/mTOR 通路影響PAMC82細(xì)胞的干性

28C10（40 μg/mL）作用4 d 后，將PAMC82 細(xì)胞進(jìn)行無血清低黏附培養(yǎng),收集富含腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞球并提取蛋白進(jìn)行WB 分析，發(fā)現(xiàn)28C10 作用后，與對(duì)照組相比，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 表達(dá)量顯著下降（圖7A），尤其是p-mTOR表達(dá)量降低最甚（P＜0.05或P＜0.01，圖7B）。以上結(jié)果提示，28C10 可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞PAMC82的干性。

圖7 28C10作用4 d后信號(hào)通路蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)量明顯下降

3 討論

胃癌是一種受幽門螺桿菌感染、不良飲食、遺傳等多種因素影響的胃黏膜癌變，有較高的發(fā)病率和病死率。由于其早期臨床癥狀和良性胃病并無顯著差異，致使多數(shù)患者就診時(shí)處于胃癌的中晚期，錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)[28]。手術(shù)治療是針對(duì)具體特定病灶的切除，對(duì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的中晚期胃癌患者來說手術(shù)效果并不理想，而且還有可能成為復(fù)發(fā)的根源。因此，對(duì)于中晚期胃癌患者，必要的輔助治療十分重要。化療作為一種惡性腫瘤的常規(guī)輔助療法，對(duì)中晚期癌癥患者進(jìn)行治療的目的是抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散，從而達(dá)到有效延長(zhǎng)患者生存期的目的。但是，越來越多的研究結(jié)果[29]發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)化療方式都出現(xiàn)了明顯耐藥現(xiàn)象，使得中晚期胃癌患者的治療再次陷入窘境。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在腫瘤化療耐藥過程中，腫瘤干細(xì)胞起著重要作用[30]。因此隨著對(duì)腫瘤干細(xì)胞亞群

研究的不斷深入，對(duì)其進(jìn)行靶向治療必將逐步發(fā)展并應(yīng)用于臨床。本研究通過HSP90單抗對(duì)胃癌細(xì)胞PAMC82 不同干細(xì)胞亞群進(jìn)行靶向治療和協(xié)同DDP聯(lián)合治療，觀察治療效果并初步探索其靶向治療可能涉及的分子機(jī)制。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)eHSP90 在腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，但其對(duì)不同腫瘤干細(xì)胞亞群的作用及相關(guān)機(jī)制仍未明確。在前列腺癌中，eHSP90參與重要的EMT過程，而這一過程又在腫瘤干細(xì)胞的適應(yīng)并耐受惡性生存環(huán)境中發(fā)揮著重要作用，EMT可使得上皮型、間質(zhì)型腫瘤干細(xì)胞在面對(duì)危機(jī)時(shí)互相轉(zhuǎn)化以適應(yīng)環(huán)境、抵抗治療，進(jìn)而促使腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。eHSP90 和epha2 在配體依賴情況下顯示出分子協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)[23]。eHSP90 在大分子的穿膜運(yùn)輸中發(fā)揮作用[31]。本研究首先發(fā)現(xiàn)在PAMC82 細(xì)胞中，eHSP90+細(xì)胞亞群與ALDH+細(xì)胞亞群和CD44+細(xì)胞亞群均存在顯著共染色重疊。在胃癌中ALDH+、CD44+細(xì)胞被認(rèn)為代表兩種不同的腫瘤干細(xì)胞亞群[32-37]，而HSP90+細(xì)胞又多為ALDH+或CD44+細(xì)胞，所以膜eHSP90 也可作為胃癌細(xì)胞干性相關(guān)的潛在標(biāo)志物，通過靶向eHSP90+細(xì)胞亞群可以有效地靶向胃癌腫瘤干細(xì)胞。本研究進(jìn)一步證實(shí)，28C10 處理后可顯著抑制PMAC82 細(xì)胞的自我更新成球能力、增殖能力、遷移和侵襲能力，同時(shí)顯著抑制ALDH+、CD44+、eHSP90+亞群細(xì)胞，大幅提高了PAMC82 細(xì)胞對(duì)DDP 的敏感性。通過相關(guān)作用機(jī)制研究，結(jié)果顯示28C10 作用后，原本位于胃癌細(xì)胞膜上的一部分eHSP90發(fā)生了內(nèi)化，并因此導(dǎo)致了這些細(xì)胞的總HSP90 量顯著下降，這可能是28C10 發(fā)揮作用的主要機(jī)制之一。另外，本研究將28C10 作用4 d 后的PAMC82 細(xì)胞進(jìn)行低黏附培養(yǎng),收集富含腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞球并提取蛋白進(jìn)行WB分析，結(jié)果顯示，腫瘤干細(xì)胞中的干性相關(guān)蛋白OCT4、SOX2表達(dá)量顯著下降，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)關(guān)鍵蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 表達(dá)量顯著下降，PI3K/AKT/mTOR 通路受到顯著抑制。綜上說明，在胃癌PAMC82 細(xì)胞中，有部分細(xì)胞表面有eHSP90；eHSP90可作為PAMC82細(xì)胞的一種潛在的腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物，以eHSP90 為靶點(diǎn)，抗HSP90 單抗28C10 可靶向eHSP90+細(xì)胞，通過使eHSP90 內(nèi)化而下調(diào)HSP90 的總量，使eHSP90+細(xì)胞及ALDH+、CD44+細(xì)胞數(shù)量下降，進(jìn)而影響PAMC82細(xì)胞的腫瘤干性、干細(xì)胞比例和增殖、耐藥等惡性潛能，顯著增強(qiáng)DDP 的抗癌效果。本研究首次報(bào)道了28C10靶向HSP90后可以增敏DDP化療效果的聯(lián)合治療新策略，其機(jī)制可能與導(dǎo)致ALDH+、CD44+亞群細(xì)胞比例下降，影響PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路，進(jìn)而影響干性基因有關(guān)。

因此，eHSP90 可作為一個(gè)有潛力的胃癌干細(xì)胞治療特異的新靶點(diǎn)，通過單抗藥物特異靶向eHSP90+亞群細(xì)胞進(jìn)行治療，可能比現(xiàn)有的靶向所有細(xì)胞的HSP90治療策略具有更好的安全性。據(jù)研究結(jié)果[38-39]顯示，eHSP90 通過低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（low-density lipoprotein-receptor-related protein 1，LRP1）向AKT 通路發(fā)出信號(hào)，在淋巴管形成過程中上調(diào)CXC18 的表達(dá)和分泌。藥物抑制AKT 可顯著延緩對(duì)ganetespib（一種HSP90小分子抑制劑）的獲得性抵抗。本課題組在今后的工作中，將結(jié)合上述線索進(jìn)一步探討并確定膜eHSP90 在胃癌中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制。