歐陽洋，李娟娟，涂毅，孫圣榮（武漢大學(xué)人民醫(yī)院 乳腺甲狀腺外科，湖北 武漢 430060）

乳腺癌是全球性的健康問題，其是全世界女性與癌癥相關(guān)的死亡的第二大主要原因[1]。盡管使用BRCA1/2突變?yōu)橹鞯母鞣N致癌基因和抑癌基因的突變?cè)u(píng)估可以很好地預(yù)測(cè)乳腺癌患者的預(yù)后和治療效果，但是因?yàn)槿橄侔┍憩F(xiàn)出高度的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，乳腺癌患者的生存率仍有待提高[2-3]。近年來分子遺傳學(xué)和生物標(biāo)志物方面的研究進(jìn)展為乳腺癌的精確診斷、個(gè)體化治療及預(yù)后判斷帶來了新的希望，找到可靠、有效的生物標(biāo)志物對(duì)乳腺癌的基礎(chǔ)研究和臨床治療意義重大。

與腫瘤發(fā)生高度相關(guān)的病癥之一是缺氧。缺氧誘導(dǎo)因子1 亞基α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF1A）在調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)中起著重要作用[4]。在正常有氧條件下，HIF1A在大多數(shù)細(xì)胞中低表達(dá)，但在缺氧條件下通常顯著上調(diào)[5]。HIF1A在多種癌癥中過表達(dá)，并與癌癥生物學(xué)的各個(gè)方面相關(guān)，包括通過誘導(dǎo)血管生成促進(jìn)腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，以及在缺氧的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝[6-9]。此外，HIF1A 還可以在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，包括巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，從而在免疫微環(huán)境中調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫[10-11]。但是關(guān)于乳腺癌組織中的HIF1A水平是否與腫瘤免疫浸潤(rùn)和臨床結(jié)局有關(guān)，尚未進(jìn)行評(píng)估。

本研究調(diào)查來自癌癥基因組圖譜（TCGA）計(jì)劃（https://cancergenome.nih.gov/）乳腺癌患者隊(duì)列中HIF1A 表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)，分析HIF1A mRNA 水平與乳腺癌患者的臨床病理特征和腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性，為揭示HIF1A 在乳腺癌中的重要作用及其與腫瘤-免疫相互作用之間的潛在關(guān)系和潛在機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 采集數(shù)據(jù)

Oncomine 數(shù)據(jù)庫（https://www.oncomine.org/resource/login.html）用于評(píng)估HIF1A在各種類型癌癥中的表達(dá)水平[12]。P=0.01，倍數(shù)變化為1.5，閾值為TOP10%，數(shù)據(jù)類型為mRNA。

在線數(shù)據(jù)庫“基因表達(dá)譜交互式分析”（GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）是一個(gè)交互式網(wǎng)站，其中包含來自TCGA 和基因型-組織表達(dá)（genotype-tissue expression,GTEx）項(xiàng)目的9 736 例腫瘤和8 587 例正常樣品中的RNA 測(cè)序表達(dá)[13]。采用GEPIA 數(shù)據(jù)對(duì)乳腺癌進(jìn)行Log-Rank 檢驗(yàn)和Mantel-Cox檢驗(yàn)，根據(jù)基因表達(dá)情況生成生存曲線，包括OS和DFS。另外，在人類蛋白質(zhì)圖譜(the human protein atlas，HPA)（https://www.proteinatlas.org/）中獲得HIF1A在乳腺癌組織與正常乳腺組織中的表達(dá)圖譜。

從TCGA數(shù)據(jù)庫中檢索了1 109例乳腺癌組織和113例正常乳腺組織的轉(zhuǎn)錄組譜和體細(xì)胞突變信息，并從cBioportal（http://cbioportal.org）檢索了相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)[14]。

1.2 HIF1A相關(guān)的信號(hào)通路富集分析

本研究根據(jù)HIF1A基因表達(dá)的中位值，將1 109個(gè)腫瘤樣品標(biāo)分為高表達(dá)組或低表達(dá)組，使用limma包進(jìn)行基因表達(dá)的差異分析，并通過比較HIF1A 高表達(dá)組樣本和低表達(dá)組樣本間的差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）。log2轉(zhuǎn)換后得分變化大于1的DEG（高表達(dá)組/低表達(dá)組）和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。借助于ClusterProfiler、Richplot 和Ggplot2 軟件包，使用R 語言對(duì)295 個(gè)DEG 進(jìn)行了基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析,僅將P值和q值均＜0.05 的項(xiàng)被認(rèn)為是顯著富集的。

1.3 腫瘤免疫分析

基于RNA-Seq數(shù)據(jù)，利用“Cibersort”R包來估計(jì)單樣本中22種免疫細(xì)胞的豐度[15]。

1.4 IHC檢測(cè)乳腺癌組織中HIF1A的表達(dá)水平

選取2011年1月至2015年12月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院收治的乳腺癌93 例，14 例良性乳腺疾病作為對(duì)照。癌組織和良性乳腺疾病組織經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋。從病歷和病理報(bào)告中提取臨床信息，所有患者均未接受化療、放療或免疫治療。本研究經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得所有患者知情簽字同意。IHC 染色如下：脫蠟、抗原修復(fù)、封閉，以一抗（HIF-1α，Abcam 公司，ab51608）處理（稀釋1∶100，37 ℃2 h），洗滌，封閉，以辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（優(yōu)寧維生物公司）處理（稀釋1∶500，37 ℃30 min），洗滌，并用二氨基聯(lián)苯胺染色。染色結(jié)果由兩位獨(dú)立的高資質(zhì)的病理醫(yī)生根據(jù)陽性染色腫瘤細(xì)胞的比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。HIF1A 的表達(dá)水平根據(jù)ImageJ 軟件計(jì)算的陽性細(xì)胞百分比來描述。腫瘤細(xì)胞比例評(píng)分：0（＜10%陽性細(xì)胞），1（10%～＜20%陽性細(xì)胞），2（20%～＜50%陽性細(xì)胞）或3（≥50%陽性細(xì)胞）。蛋白質(zhì)染色強(qiáng)度評(píng)分：0（無染色），1（弱染色，淺棕色），2（中度染色，棕色）或3（強(qiáng)染色，深棕色）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0和R4.0.1軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示，采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，用Kaplan-Meier 法繪制患者生存曲線，生存率的比較采用Log-Rank檢驗(yàn)。HIF1A表達(dá)量與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系分析使用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，采用Spearman偏相關(guān)分析法分析HIF1A 基因表達(dá)與腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HIF1A高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后較好

利用Oncomine數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析了各種類型癌癥的腫瘤組織和正常組織中HIF1A mRNA 的水平，與正常組織相比，HIF1A 在大多數(shù)腫瘤組織（包括膀胱癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、宮頸癌、胃癌、腎癌、白血病、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肉瘤）中的表達(dá)均較高（圖1A）。此外，通過檢測(cè)HPA中數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，HIF1A 在乳腺癌組織中表達(dá)較強(qiáng)，而在正常乳腺組織中表達(dá)較弱或呈陰性（圖1B、C），進(jìn)一步在臨床病理方面驗(yàn)證了HIF1A 在乳腺癌中高表達(dá)的趨勢(shì)。

接著分析了HIF1A表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)HIF1A與乳腺癌DFS 顯著相關(guān)，低HIF1A表達(dá)組預(yù)后明顯差于HIF1A 高表達(dá)組（HR=0.67，P=0.036），但未觀察到HIF1A 與乳腺癌患者OS 之間有明顯的相關(guān)性（HR=1.2，P=0.2）（圖1D、E）。因此，可以推斷，HIF1A低表達(dá)可能是乳腺癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。

圖1 HIF1A在乳腺癌患者中的表達(dá)水平及其與患者生存關(guān)系的分析

2.2 乳腺癌組織中HIF1A的表達(dá)與病理特征的關(guān)系

為了研究乳腺癌中HIF1A表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，采用中位數(shù)切割法，計(jì)算得截?cái)嘀禐? 442 counts，根據(jù)此值將乳腺癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF1A 與患者雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕酮受體（progesterone receptor，PR）和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表達(dá)明顯有關(guān)聯(lián)（表1）。接下來，在TCGA數(shù)據(jù)集中進(jìn)一步檢測(cè)到腫瘤組織中HIF1A 在ER 陰性組、PR 陰性組和HER2 陽性組中表達(dá)上調(diào)（圖2A～C）。還觀察到HIF1A 在基底樣乳腺癌和HER2 過表達(dá)型乳腺癌比luminal A、luminal B及正常組織中的表達(dá)明顯升高，而在luminal A和luminal B乳腺癌亞型中沒有發(fā)現(xiàn)差異（圖2D）。

圖2 在TCGA隊(duì)列中HIF1A在不同的ER（A）、PR（B）、HER2（C）狀態(tài)和分子亞型（D）腫瘤組織中的表達(dá)

表1 TCGA隊(duì)列中HIF1A mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 中國(guó)人乳腺癌組織中HIF1A高表達(dá)

HIF1A 在國(guó)人乳腺癌組織中的病理表達(dá)特征見表2。與乳腺良性組織相比，乳腺癌中HIF1A表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01；圖3）。分析乳腺癌各個(gè)亞型中HIF1A 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，各個(gè)亞型中HIF1A 的表達(dá)水平均升高（均P＜0.01），但是沒有觀察到各個(gè)亞型之間HIF1A 表達(dá)水平的差異。以Kaplan-Meier 分析乳腺癌患者RFS表明，表達(dá)低水平HIF1A 的患者比表達(dá)高水平HIF1A 組的患者預(yù)后更差（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，中國(guó)人癌組織標(biāo)本中HIF1A低表達(dá)可能是乳腺癌患者預(yù)后不良的因素，可以作為乳腺癌患者預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)。

圖3 中國(guó)人乳腺癌組織中HIF1A的表達(dá)水平及其與患者DFS的關(guān)系

表2 HIF1A在中國(guó)人乳腺癌組織中的病理表達(dá)特征[n(%)]

2.4 與HIF1A 相關(guān)的DEG 與乳腺癌的免疫功能密切相關(guān)

為了探索乳腺癌中HIF1A表達(dá)相關(guān)的生物學(xué)過程，對(duì)HIF1A 高表達(dá)組和低表達(dá)組樣本進(jìn)行DEG 分析，總共獲得了295 個(gè)DEG，其中179 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、116 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。隨后，進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。GO 富集分析結(jié)果表明，HIF1A參與白細(xì)胞趨化反應(yīng)、由抗菌肽介導(dǎo)的抗體液免疫反應(yīng)、粒細(xì)胞趨化反應(yīng)、趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和嗜中性粒細(xì)胞趨化反應(yīng)等（圖4A）。KEGG 富集分析還顯示了細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體間相互作用通路和IL-17 信號(hào)通路（圖4B）。結(jié)果表明，HIF1A 表達(dá)與乳腺癌患者的免疫功能相關(guān)，提示HIF1A可能參與乳腺癌TME的調(diào)節(jié)。

圖4 GO（A）和KEGG（B）富集分析顯示HIF1A相關(guān)DEG與免疫功能有關(guān)

2.5 HIF1A 表達(dá)影響腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞（tumorinfiltrating immune cell，TIC）的群譜特性

為了進(jìn)一步證實(shí)HIF1A 表達(dá)與TME 的相關(guān)性，使用Cibersort算法分析了TIC亞群的比例，并在乳腺癌樣品中構(gòu)建了22 種免疫細(xì)胞譜。差異分析發(fā)現(xiàn)，HIF1A高表達(dá)組表現(xiàn)出較高水平的靜息記憶CD4+T細(xì)胞（P＜0.01）、活化記憶CD4+T 細(xì)胞（P＜0.000 1）、M0 型巨噬細(xì)胞（P＜0.01）和M1 型巨噬細(xì)胞（P＜0.01）。另外，HIF1A 高表達(dá)組表現(xiàn)出較低水平的Treg 細(xì)胞（P＜0.01）、活化NK 細(xì)胞（P＜0.000 1）、單核細(xì)胞（P＜0.01）、M2型巨噬細(xì)胞（P＜0.001）和靜息肥大細(xì)胞（P＜0.000 1）（圖5A）。相關(guān)性分析表明，總共8 種TIC 與HIF1A 的表達(dá)相關(guān)，其中記憶型B 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞、活化NK細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞與HIF1A 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而靜息記憶CD4+T 細(xì)胞、活化記憶CD4+T 細(xì)胞、M1 型巨噬細(xì)胞與HIF1A 表達(dá)呈正相關(guān)（圖5B）。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了HIF1A表達(dá)水平影響TME的免疫活性。

圖5 HIF1A表達(dá)與TIC群譜相關(guān)性分析

3 討論

缺氧是導(dǎo)致腫瘤侵襲性微環(huán)境最常見的特征之一。瘤內(nèi)低氧激活HIF-1 和HIF-2，在幾種人類癌癥中已證明HIF1A的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和死亡率密切相關(guān)[16]。特別是在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、成血管細(xì)胞瘤、結(jié)腸腺癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌的亞型中觀察到HIF1A 高表達(dá)，HIF1A 是缺氧、血管生成、細(xì)胞增殖、代謝、癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的主要調(diào)節(jié)劑[17]。本研究結(jié)果表明，與正常乳腺組織相比，HIF1A 在乳腺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，并且與乳腺癌患者良好DFS 預(yù)后相關(guān)。然而，一些文獻(xiàn)報(bào)道了HIF1A 在乳腺癌中的致癌和促癌作用。EBRIGHT等[8]報(bào)道了HIF1A信號(hào)選擇性促進(jìn)了乳腺癌腦轉(zhuǎn)移，CHEN 等[18]也報(bào)道了HIF1A 可以誘導(dǎo)表觀遺傳閱讀器鋅指MYND 型8（eigenetic reader zinc finger MYND-type containing 8，ZMYND8）表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)體外乳腺癌細(xì)胞集落的形成、遷移和侵襲，并促進(jìn)了小鼠乳腺腫瘤的生長(zhǎng)和向肺的轉(zhuǎn)移。造成這種不一致的主要原因是本研究在整體水平上分析了HIF1A 的表達(dá)。KACHAMAKOVA-TROJANOWSKA 等[19]最近的研究也支持了本研究的發(fā)現(xiàn)，HIF1A的穩(wěn)定化可降低腫瘤細(xì)胞的侵襲性，在體外和體內(nèi)的乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮抗癌作用，并增強(qiáng)了吉西他濱化療的療效。此外，TIWARI 等[20]研究結(jié)果也表明，HIF1A 可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞中p53蛋白的降解來發(fā)揮腫瘤抑制作用，胰腺癌細(xì)胞中HIF1A的缺失增加了他們的侵襲和轉(zhuǎn)移活性。這些數(shù)據(jù)共同表明，HIF1A在乳腺癌中發(fā)揮著抑癌和促癌的雙重作用[21-22]。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在TCGA 隊(duì)列中HIF1A mRNA 水平與ER、PR 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，和HER2 的狀態(tài)呈正相關(guān)。其中HIF1A 在HER2 過表達(dá)型乳腺癌中表達(dá)最高，這與之前報(bào)道的HER2 通過增加PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來增加HIF1A 水平相一致[23]。此外在一些研究中發(fā)現(xiàn)，患者乳腺腫瘤中的HIF1A免疫組化表達(dá)水平與HER2陽性相關(guān)[24]。

HIF1A 參與了腫瘤相關(guān)炎癥信號(hào)的內(nèi)源性和外源性激活[25]。實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)速度最終超過氧氣和營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)，導(dǎo)致局部壞死[16,25]。腫瘤的缺氧和壞死區(qū)域反過來產(chǎn)生促炎介質(zhì)，招募更多的免疫細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤部位的免疫反應(yīng)以及抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移[25-26]。本研究通過GO 和KEGG富集分析，證實(shí)了HIF1A 與乳腺癌中免疫活性以及炎癥反應(yīng)有關(guān)，例如白細(xì)胞趨化反應(yīng)、趨化因子反應(yīng)、IL-17信號(hào)通路等。

HIF1A作為缺氧的主要調(diào)節(jié)因子，可直接或間接調(diào)控缺氧介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸[27-28]，在免疫調(diào)控和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[10-11,29]。與腫瘤細(xì)胞一樣，浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞也暴露在缺氧環(huán)境中，因?yàn)樗麄儚母缓鯕獾难髦型庖绲窖装Y部位，從而激活免疫細(xì)胞中的HIF1A[30]。而髓細(xì)胞中HIF1A 的缺失導(dǎo)致細(xì)胞ATP池的減少，并且嚴(yán)重?fù)p害了髓細(xì)胞聚集、運(yùn)動(dòng)性、侵襲性、抗菌活性和存活時(shí)間[30-31]。在癌癥免疫學(xué)的背景下，Treg 細(xì)胞可以抑制自身反應(yīng)性T 細(xì)胞，從而發(fā)揮抑制腫瘤免疫的作用，Treg 細(xì)胞數(shù)量多與CD8+T細(xì)胞比例低與預(yù)后不良相關(guān)[32]。在本研究中，通過Cibersort軟件對(duì)TIC比例進(jìn)行分析結(jié)果表明，乳腺癌患者中Treg 細(xì)胞與HIF1A 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)HIF1A與M0和M2型巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，與M1 型巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)。巨噬細(xì)胞在TME 中浸潤(rùn)非常豐富，在一些惡性腫瘤中他們的高浸潤(rùn)與不良預(yù)后和治療耐藥性相關(guān)[33]。由于他們的可塑性，巨噬細(xì)胞可以極化為促炎、抗腫瘤M1 型或極化為抗炎、促腫瘤M2型[34]。M1型巨噬細(xì)胞通過分泌促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，并專職提呈抗原，參與正向免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫監(jiān)視的功能。而M2型巨噬細(xì)胞僅有較弱抗原提呈能力，并通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10或TGF-B等下調(diào)免疫應(yīng)答，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[35]。以上這些結(jié)果表明，HIF1A低表達(dá)抑制了腫瘤內(nèi)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)Treg 細(xì)胞、抗炎M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，促炎M1 型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少，形成腫瘤免疫抑制微環(huán)境，導(dǎo)致免疫逃逸，這可能是乳腺癌患者預(yù)后不良的原因。總之，乳腺癌患者的TIC 與HIF1A 密切相關(guān)，提示HIF1A 可能是維持TME中免疫活性的重要因素。

必須承認(rèn)本研究存在局限性。首先是缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來證實(shí)HIF1A在乳腺癌生長(zhǎng)和進(jìn)展中的作用及其與TME 中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系。因此，需要進(jìn)一步的研究以驗(yàn)證HIF1A在使用這些模型的乳腺癌中的作用。其次，本研究缺少對(duì)調(diào)控HIF1A 具體機(jī)制的研究，有必要進(jìn)一步探索乳腺癌中HIF1A 可能的調(diào)控因子。