王佳佳，李霞（河南大學(xué) 抗體藥物開發(fā)技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475000）

糖代謝標(biāo)記是指將含有化學(xué)標(biāo)簽的非天然糖經(jīng)過細(xì)胞代謝添加到天然糖鏈結(jié)構(gòu)中，通過化學(xué)反應(yīng)可對(duì)相應(yīng)的化學(xué)標(biāo)簽進(jìn)一步標(biāo)記，從而應(yīng)用于細(xì)胞成像、蛋白質(zhì)富集或靶向治療等領(lǐng)域。通過該標(biāo)記方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜標(biāo)記，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性或提高免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別。糖代謝標(biāo)記可為腫瘤靶向治療提供新的策略，有望解決尚缺乏有效靶標(biāo)的腫瘤類型的治療難題。

1 糖代謝標(biāo)記的獨(dú)特性原理為其在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)

20世紀(jì)90 年代，KAYSER 等[1]發(fā)現(xiàn)，唾液酸合成前體N-乙酰甘露糖胺（N-acetyl-mannosamine,ManNAc）類似物N-丙酰甘露糖胺可以在大鼠體內(nèi)多個(gè)器官中代謝并整合到聚糖結(jié)構(gòu)中。MAHAL等[2]受到上述研究結(jié)果的啟發(fā)，設(shè)計(jì)并合成了非天然糖分子ManNAc 類似物N-4-氧代戊酰甘露糖胺（N-levulinoyl mannosamine，ManLev）。ManLev 經(jīng)細(xì)胞內(nèi)代謝酶作用后可以轉(zhuǎn)化為N-4-氧代戊酰唾液酸，進(jìn)而可取代天然唾液酸，參與細(xì)胞膜糖鏈的組裝，最終在細(xì)胞膜表面糖鏈結(jié)構(gòu)中引入了新的化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)——酮基官能團(tuán)，其中的酮基和酰肼基可以通過發(fā)生配對(duì)化學(xué)反應(yīng)來引入熒光基團(tuán)或生物素，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的熒光標(biāo)記或生物素標(biāo)記。該過程所需的非天然糖分子需要經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)脫酯酶和代謝通路中其他酶的代謝加工成相應(yīng)的糖基供體，進(jìn)而參與到細(xì)胞糖鏈的合成和組裝，最終實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的標(biāo)記，因此被稱為糖代謝標(biāo)記（metabolic glycan labeling，MGL）。鑒于糖代謝標(biāo)記的原理，所有參與糖鏈組裝的糖基供體的類似物均可代謝到相應(yīng)的糖鏈結(jié)構(gòu)中進(jìn)行標(biāo)記。除ManNAc 類似物外，目前已發(fā)現(xiàn)甘露糖[3]、半乳糖[4-5]、巖藻糖[6]、唾液酸[7]、乙酰氨基葡萄糖[8-13]和葡萄糖[14-17]等多種糖的類似物，均可用來進(jìn)行糖代謝標(biāo)記，且都具有良好的標(biāo)記效果，進(jìn)一步提高了糖代謝標(biāo)記中非天然糖分子的可選擇性。此外，還可以對(duì)同一天然糖分子進(jìn)行不同類型的化學(xué)修飾，以進(jìn)一步擴(kuò)充糖分子探針的種類并提高代謝標(biāo)記效率。SAXON 等[18]于2000年首次報(bào)道了疊氮基取代的ManNAc類似物N-azidoacetyl mannosamine（ManNAz），其進(jìn)入細(xì)胞后可以通過唾液酸合成通路轉(zhuǎn)化成含疊氮的唾液酸（SiaNAz）分子，進(jìn)而整合到細(xì)胞膜表面的糖鏈結(jié)構(gòu)中，從而在細(xì)胞膜表面人為地添加上了疊氮基團(tuán)，而后通過疊氮基與三苯基磷的配對(duì)反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的標(biāo)記。

MAHAL 和SAXON 等[2,15]開發(fā)了兩種ManNAc 類似物ManLev 和ManNAz，兩者在進(jìn)行糖代謝標(biāo)記時(shí)，利用的化學(xué)反應(yīng)分別是酮基/酰肼基的配對(duì)反應(yīng)和疊氮基-三苯基磷的配對(duì)反應(yīng)。此類化學(xué)反應(yīng)被稱之為生物正交反應(yīng)（bioorthogonal reaction），是指在不干擾生物自身生化反應(yīng)條件下能夠在活體細(xì)胞或組織中進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，參加反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)具有惰性、空間位阻小、天然狀態(tài)下不存在于生物體內(nèi)、水溶性好且具有較高的反應(yīng)效率等特點(diǎn)。酮基-酰肼基的反應(yīng)條件較為嚴(yán)苛，需要在弱酸條件下才能發(fā)生，由于體內(nèi)含有較多的酮基結(jié)構(gòu)，故容易造成非特異性反應(yīng)。疊氮基-三苯基磷的反應(yīng)速率較為緩慢，影響了其標(biāo)記效率。目前，糖代謝標(biāo)記所采用的生物正交反應(yīng)，除了以上兩種配對(duì)基團(tuán)之外，還有炔基/疊氮基、疊氮基/二苯并環(huán)辛炔（dibenzocyclooctyne，DBCO）等（圖1A）。其中疊氮基/DBCO 反應(yīng)又被稱為“環(huán)張力促使的環(huán)加成（strain-promoted alkyne-azide cycloaddition,SPAAC）”策略，該反應(yīng)由于不需要銅離子催化，并且DBCO與疊氮基團(tuán)反應(yīng)活性高，可以快速、高效地發(fā)生共價(jià)連接而形成復(fù)合物。該策略已應(yīng)用于斑馬魚和小鼠的體內(nèi)標(biāo)記，并取得了良好的標(biāo)記效果[19-21]，這也是目前生物體內(nèi)糖代謝標(biāo)記應(yīng)用最為廣泛的生物正交反應(yīng)[22-24]。

基于糖代謝標(biāo)記的獨(dú)特性原理，糖代謝標(biāo)記具有以下特點(diǎn)：（1）密度高，細(xì)胞膜表面具有豐富的糖鏈結(jié)構(gòu)，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的糖鏈通常由9 種基本的單糖分子通過不同組合排列組裝形成，糖代謝標(biāo)記非天然糖分子通過細(xì)胞代謝替代原有的天然單糖分子參與糖鏈的組裝，從而使其在細(xì)胞表面標(biāo)記具有較高的覆蓋率（約1×107個(gè)/細(xì)胞），比高表達(dá)抗原多出10 倍～1 000 倍[25-26]；（2）可進(jìn)行活體標(biāo)記，糖代謝標(biāo)記利用生物正交反應(yīng)對(duì)細(xì)胞膜的相應(yīng)化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，可以在不干擾生物自身生化反應(yīng)條件下進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)活體標(biāo)記，該方法已應(yīng)用于細(xì)菌、斑馬魚、小鼠等的活體標(biāo)記和活體成像，這為靶向治療提供了可能；（3）干擾小，非天然糖分子通過糖代謝標(biāo)記僅對(duì)糖鏈中相應(yīng)單糖分子進(jìn)行了化學(xué)基團(tuán)的修飾，如疊氮基或者炔基等，這些化學(xué)修飾空間位阻小，一般不會(huì)影響或干擾細(xì)胞間的識(shí)別與信息傳遞；（4）低毒性，通過代謝標(biāo)記所引入的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因其分子量較小、抗原性弱，不易引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)激等不良反應(yīng)，具有較高的安全性?；谝陨咸攸c(diǎn)，糖代謝標(biāo)記結(jié)合生物正交反應(yīng)策略可以對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行高密度的半抗原、抗原、化療藥物及細(xì)胞毒性藥物等的標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別或激活機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答；還可以在不影響免疫細(xì)胞正常功能活性的情況下，通過對(duì)免疫細(xì)胞的標(biāo)記增加其對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別和結(jié)合，使其除了用于細(xì)胞成像、蛋白富集之外，還可以應(yīng)用于腫瘤靶向治療[27-28]（圖1B）。

圖1 糖分子探針在生物標(biāo)記中的應(yīng)用示意圖

2 基于糖代謝標(biāo)記的原理及特點(diǎn)而提出的腫瘤靶向治療新策略

隨著腫瘤靶向治療的興起，尤其是首個(gè)抗體靶向藥物和小分子靶向藥物曲妥珠單抗和伊馬替尼在乳腺癌和白血病治療中極大地提高了患者的5 年生存率，使人們看到了腫瘤治療的希望。如何提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性是腫瘤靶向治療的關(guān)鍵。但是近年來腫瘤細(xì)胞表面的特異性靶點(diǎn)，例如腫瘤特異性抗原研究及應(yīng)用進(jìn)展緩慢，急需通過新的技術(shù)手段為腫瘤靶向治療提供新的特異靶點(diǎn)。糖代謝標(biāo)記以其可以活體標(biāo)記并且密度高、低毒性、干擾小的特點(diǎn)使其為腫瘤細(xì)胞提供高密度的特異靶點(diǎn)成為可能。

2.1 基于腫瘤細(xì)胞標(biāo)記的應(yīng)用策略

通過糖代謝標(biāo)記策略在腫瘤細(xì)胞表面添加半抗原、抗原、化療藥物或細(xì)胞毒性藥物等，以激活機(jī)體免疫應(yīng)答、提供有效腫瘤治療靶點(diǎn)或提高化療藥物或細(xì)胞毒性藥物的腫瘤靶向性，進(jìn)而提高對(duì)腫瘤組織的殺傷作用。

2.1.1 腫瘤細(xì)胞標(biāo)記半抗原以激活機(jī)體免疫應(yīng)答 機(jī)體的免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的免疫監(jiān)視功能，并且抗腫瘤免疫應(yīng)答在殺傷或清除腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，但是腫瘤細(xì)胞會(huì)通過抗原缺失和抗原調(diào)變等多種機(jī)制發(fā)生免疫逃逸，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。通過糖代謝標(biāo)記在腫瘤細(xì)胞膜表面進(jìn)行半抗原標(biāo)記可有效激活機(jī)體免疫應(yīng)答。ZHAO 等[29]利用非天然糖分子Ac4ManNAz 在乳腺癌和肺癌細(xì)胞表面標(biāo)記半抗原三酰酯肽[Pam3CSK4/Pam3Cys-Ser-(Lys)4]，從而增加了腫瘤細(xì)胞的抗原性，該半抗原標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞可以激活小鼠的體液免疫反應(yīng)和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而有效抑制腫瘤的發(fā)生。

2.1.2 腫瘤細(xì)胞標(biāo)記抗原以提供有效治療靶點(diǎn) 糖代謝標(biāo)記還可以在腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記已知抗原，從而為腫瘤靶向治療提供有效治療靶點(diǎn)。以乳腺癌為例，目前針對(duì)乳腺癌的腫瘤特異性抗原HER2 開發(fā)的腫瘤靶向抗體藥物曲妥珠單抗，在HER2 陽(yáng)性的乳腺癌治療中可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞，取得良好的臨床療效，但是針對(duì)HER2 陰性的乳腺癌例如三陰性乳腺癌則療效甚微[30]。糖代謝標(biāo)記可以在三陰性乳腺癌細(xì)胞表面標(biāo)記已知抗原——HER2 抗原，從而為應(yīng)用曲妥珠單抗靶向殺傷三陰性乳腺癌等缺乏有效靶標(biāo)的腫瘤類型提供可能。

2.1.3 通過糖代謝標(biāo)記實(shí)現(xiàn)化療藥物、細(xì)胞毒性藥物等的腫瘤靶向性 傳統(tǒng)的化療藥物或細(xì)胞毒性藥物因其缺乏靶向性，往往會(huì)對(duì)機(jī)體正常組織和細(xì)胞造成損傷，從而引起多種不良反應(yīng)。利用糖代謝標(biāo)記方法可以在腫瘤細(xì)胞膜表面標(biāo)記上疊氮基或DBCO基團(tuán)，然后通過生物正交反應(yīng)，與DBCO或疊氮基偶聯(lián)的化療藥物可以特異性地與腫瘤細(xì)胞靶向結(jié)合，從而降低化療藥物的不良反應(yīng)。TOMáS 等[31]通過糖代謝標(biāo)記在腫瘤細(xì)胞膜表面添加疊氮基團(tuán)，然后與DBCO-化療藥聚合物通過共價(jià)結(jié)合使得化療藥聚合物的半最大效應(yīng)濃度（EC50）提高10倍，該策略不但可以促使細(xì)胞膜破損，還可以通過糖循環(huán)內(nèi)化方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為非傳統(tǒng)的生物大分子治療藥物提供了新的途徑。WANG 等[32]在三陰性乳腺癌、前列腺癌等動(dòng)物模型中，通過活體特異性標(biāo)記，在腫瘤細(xì)胞膜表面標(biāo)記疊氮基團(tuán)，隨后通過尾靜脈注射DBCO-多柔比星，發(fā)現(xiàn)能夠有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存期比對(duì)照小鼠提高了62%。另外，WANG等[33]將DBCO修飾的非天然糖分子Ac4ManN-DBCO在腫瘤原位注射，可以高效標(biāo)記LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞，隨后利用位阻較小的疊氮基團(tuán)標(biāo)記超微硅納米顆粒，該策略首次證明了較大位阻的修飾基團(tuán)DBCO不影響非天然糖分子在細(xì)胞內(nèi)的代謝標(biāo)記，聯(lián)合疊氮基標(biāo)記的納米載藥系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)理想的標(biāo)記和治療效果。

2.2 基于免疫細(xì)胞標(biāo)記的應(yīng)用策略

隨著T 細(xì)胞及NK 細(xì)胞免疫治療的發(fā)展，糖代謝標(biāo)記基于T細(xì)胞和NK細(xì)胞修飾的應(yīng)用可以為CAR-T、TCR-T以及CAR-NK細(xì)胞治療提供更多的靶點(diǎn)選擇性。

2.2.1 標(biāo)記T 細(xì)胞以擴(kuò)展T 細(xì)胞免疫治療的應(yīng)用范圍 CAR-T 細(xì)胞療法在血液系統(tǒng)腫瘤治療中取得了突破性進(jìn)展[34-37]，但因尚缺乏特異性腫瘤靶標(biāo)而限制了CAR-T 療法在實(shí)體腫瘤中的應(yīng)用。糖代謝標(biāo)記策略可以在免疫細(xì)胞膜表面引入特異性靶標(biāo)分子，使其可以特異性識(shí)別實(shí)體腫瘤細(xì)胞，從而發(fā)揮靶向治療作用，進(jìn)一步拓展其在實(shí)體腫瘤中應(yīng)用的可能性。LIU等[38]通過糖代謝標(biāo)記在CD3+T細(xì)胞表面引入腫瘤細(xì)胞表面特異性適配體單鏈DNA，成功制備了具有靶向SGC-7901 胃癌細(xì)胞和CT26 結(jié)腸癌細(xì)胞功能的適配體-T（aptamer-T）細(xì)胞。適配體-T 細(xì)胞通過改善腫瘤微環(huán)境并促進(jìn)細(xì)胞毒性因子的釋放，如穿孔素、顆粒酶、CD107a 等，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著抑制效果；此外，PD-L1 適配體修飾的T（aptPD-L1-CD3+T）細(xì)胞對(duì)小鼠結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤效果，可延緩腫瘤進(jìn)程并提高荷瘤小鼠生存率，而且aptPD-L1-CD3+T 細(xì)胞的抑瘤作用優(yōu)于PD-1 抗體，如兩者聯(lián)用對(duì)CT26細(xì)胞的抑制作用更為顯著。

2.2.2 標(biāo)記NK 細(xì)胞以提高NK 細(xì)胞免疫治療的靶向性 NK細(xì)胞是固有免疫中直接殺傷腫瘤細(xì)胞的重要組成部分，NK 細(xì)胞療法已成為當(dāng)今免疫治療研究的熱點(diǎn)。通過糖代謝標(biāo)記亦可對(duì)NK 細(xì)胞膜進(jìn)行標(biāo)記，添加特異性靶標(biāo)，從而讓NK 細(xì)胞的殺傷作用具有更高的靶向性。在血液系統(tǒng)腫瘤中，可以利用淋巴細(xì)胞等表達(dá)的細(xì)胞特異性表面分子對(duì)NK 細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。WANG 等[39]通過糖代謝標(biāo)記方法，將B細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD22的配體間苯氧基苯甲酸（m-phenoxybenzoic acid，MPB）標(biāo)記到NK細(xì)胞膜表面，MPB標(biāo)記后的NK細(xì)胞對(duì)CD22+淋巴細(xì)胞具有較高的殺傷作用，無論是CD22+細(xì)胞系還是腫瘤患者來源的淋巴細(xì)胞，其殺傷效果與標(biāo)記程度均呈現(xiàn)濃度依賴性，并且該標(biāo)記對(duì)NK細(xì)胞所分泌的穿孔素、顆粒酶及IFN-γ等炎癥因子的殺傷功能無影響，該策略在小鼠腫瘤模型中可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)且延長(zhǎng)荷瘤鼠生存期。對(duì)于缺乏特異性腫瘤靶標(biāo)的實(shí)體腫瘤來說，可以利用已上市的腫瘤抗體藥物及其靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記。例如WANG等[40]通過糖代謝標(biāo)記在NK-92細(xì)胞表面引入西妥昔單抗，被標(biāo)記的NK-92細(xì)胞對(duì)表達(dá)EGFR和KRAS基因突變體的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞具有很高的細(xì)胞毒性，并且在腫瘤組織中積累和浸潤(rùn)，顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。

2.3 基于腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞雙標(biāo)記的應(yīng)用策略

免疫細(xì)胞作為抗腫瘤免疫的主力軍，其發(fā)揮抗腫瘤免疫應(yīng)答的前提是其在腫瘤部位的浸潤(rùn)，并有效識(shí)別腫瘤表面抗原。通過糖代謝標(biāo)記策略可以同時(shí)在腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞表面進(jìn)行成對(duì)標(biāo)記，以促使兩種細(xì)胞更易接近從而加強(qiáng)免疫細(xì)胞的靶向性，并且可與光敏等仿生納米新材料聯(lián)合應(yīng)用以增強(qiáng)光熱等物理療法的靶向性。

2.3.1 提高細(xì)胞間的易接近性 免疫細(xì)胞在腫瘤組織的浸潤(rùn)及其與腫瘤細(xì)胞的空間靠近是殺傷腫瘤細(xì)胞的先決條件。在糖代謝標(biāo)記中，利用生物正交反應(yīng)或聯(lián)合化學(xué)主客體結(jié)構(gòu)，將生物正交反應(yīng)的配對(duì)化學(xué)基團(tuán)或配對(duì)的主客體結(jié)構(gòu)分別偶聯(lián)或標(biāo)記在腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞膜表面，通過化學(xué)基團(tuán)或主客體結(jié)構(gòu)的成對(duì)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的空間靠近，通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的相互作用調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)達(dá)到治療腫瘤的目的。LI等[41]分別用全乙?；疦-雙環(huán)[6.1.0]壬炔-甘露糖胺（Ac4ManN-BCN）和全乙酰化疊氮乙?；肴樘前罚ˋc4GalNAz）標(biāo)記腫瘤細(xì)胞和T 細(xì)胞并將其共同培養(yǎng)，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，疊氮標(biāo)記的T細(xì)胞與雙環(huán)[6,1,0]壬炔（BCN）修飾的腫瘤細(xì)胞可以充分靠近，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率可提高2～4倍。PLUMET等[42]通過在腫瘤細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞表面修飾互補(bǔ)的主客體結(jié)構(gòu)三聚物β-環(huán)糊精和金剛烷，當(dāng)主客體相遇時(shí)可以促使腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞的空間靠近，通過刺激T細(xì)胞分泌IL-2進(jìn)而活化NK細(xì)胞，最終實(shí)現(xiàn)殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。

2.3.2 實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞的靶向性 可以通過聯(lián)合腫瘤細(xì)胞和T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞的標(biāo)記策略，將天然的成對(duì)受體配體或體外篩選的抗原抗體對(duì)通過糖代謝標(biāo)記的方法分別標(biāo)記到腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的膜表面，從而實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別。此種策略可以為缺乏腫瘤特異性靶標(biāo)的腫瘤提供靶向治療方案，進(jìn)而通過腫瘤細(xì)胞活體標(biāo)記聯(lián)合體外標(biāo)記T或NK 細(xì)胞的免疫療法實(shí)現(xiàn)。目前，針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)通過多種方法在動(dòng)物模型中得以實(shí)現(xiàn)，而針對(duì)免疫細(xì)胞的糖代謝標(biāo)記策略主要在體外體系中開展研究，尚缺乏免疫細(xì)胞體內(nèi)標(biāo)記的方法。

2.3.3 提高光熱等物理療法的靶向性 糖代謝標(biāo)記方法也可以與光敏劑等新材料聯(lián)合應(yīng)用，以提高腫瘤光熱治療的特異性和靶向性。例如HAN 等[43]利用糖代謝標(biāo)記技術(shù)在T細(xì)胞表面進(jìn)行疊氮基標(biāo)記，然后提取細(xì)胞膜并與吲哚菁綠聚合物整合形成仿生納米光敏劑，該仿生納米光敏劑擁有完整的被疊氮基標(biāo)記的T細(xì)胞膜，可以與BCN標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞發(fā)生高效、特異的生物正交反應(yīng)，從而使光敏材料特異性聚集在腫瘤組織局部。與未修飾的腫瘤細(xì)胞相比，該策略可使光熱治療效率提高1.5倍，為腫瘤靶向治療提供新思路。

2.4 基于外泌體或細(xì)胞外囊泡標(biāo)記的應(yīng)用策略

糖代謝標(biāo)記外泌體或細(xì)胞外囊泡技術(shù)可以進(jìn)一步增加外泌體或細(xì)胞外囊泡的靶向性。例如，為了增強(qiáng)外泌體對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的炎癥部位的靶向能力，YOU 等[44]利用糖代謝標(biāo)記對(duì)脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞膜表面進(jìn)行了葡聚糖標(biāo)記，而后通過外泌體技術(shù)形成葡聚糖標(biāo)記的外泌體（dextran sulfate-exosomes，DS-EXO），該DS-EXO 可以靶向RA 炎癥部位中活化的M1 型巨噬細(xì)胞，通過誘導(dǎo)M1 向M2 型巨噬細(xì)胞的極化，從而抑制局部炎癥反應(yīng)，為RA 提供了一種新的治療系統(tǒng)。該調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞異質(zhì)性的靶向策略可以擴(kuò)展到各種與巨噬細(xì)胞相關(guān)的疾病，如炎癥性腸病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默病和腫瘤等。此外，該團(tuán)隊(duì)還通過糖代謝標(biāo)記策略將可靶向CD44 分子的聚乙二醇/透明質(zhì)酸標(biāo)記到細(xì)胞膜表面，從而形成可靶向CD44 的細(xì)胞外囊泡，該細(xì)胞外囊泡可通過血液循環(huán)在腫瘤和關(guān)節(jié)炎處聚集，為細(xì)胞外囊泡在體內(nèi)的靶向運(yùn)輸和治療提供了可靠的實(shí)施途徑[45]。

3 腫瘤細(xì)胞活體特異性糖代謝標(biāo)記的策略

實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的活體特異性標(biāo)記是糖代謝標(biāo)記策略在腫瘤靶向治療中的關(guān)鍵。目前，研究人員已開發(fā)出腫瘤原位注射、腫瘤自身特異性酶類、靶向運(yùn)輸載體等策略以實(shí)現(xiàn)非天然糖分子在腫瘤組織的活體靶向標(biāo)記。

3.1 腫瘤原位注射策略

實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的特異性標(biāo)記是開展腫瘤靶向治療的前提。腫瘤原位注射是實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記最直接、簡(jiǎn)便的方法[46-49]。例如,HU 等[46]在小鼠4T1 腫瘤組織原位注射非天然糖分子疊氮基取代的乙?；僖核?，隨后尾靜脈注射BCN修飾的聚集誘導(dǎo)發(fā)光的光敏劑，結(jié)果表明，該新型光敏劑在疊氮基預(yù)處理的腫瘤部位局部特異性聚集發(fā)光，展現(xiàn)了良好的選擇性標(biāo)記效果，該研究為體內(nèi)腫瘤靶向標(biāo)記提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。腫瘤原位注射策略操作簡(jiǎn)單、效果顯著，但在未知腫瘤位置以及深部時(shí)，其應(yīng)用具有局限性。

3.2 利用腫瘤自身特異性酶類的策略

根據(jù)腫瘤自身所含特異性水解酶的特點(diǎn)，研究者開發(fā)了一系列含有可被腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異酶調(diào)控的保護(hù)基團(tuán)的非天然糖分子，用于實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的體內(nèi)特異性標(biāo)記。例如，有研究[47]利用腫瘤組織高表達(dá)組織蛋白酶B的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了含有Lys-Gly-Arg-Arg（KGRR）肽段的ManNAz 類似物——RR-SAc3ManNAz（其中S 為對(duì)氨基芐氧羰基連接臂），該非天然糖分子的“RR”二肽結(jié)構(gòu)只有在高表達(dá)組織蛋白酶B 的腫瘤細(xì)胞內(nèi)被特異性水解，釋放出的ManNAz進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)特異性糖代謝標(biāo)記人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29。該研究基于腫瘤自身組織蛋白酶B 高表達(dá)的特點(diǎn)，為腫瘤的靶向標(biāo)記和靶向治療提供了新思路。此外，CHANG等[50]根據(jù)前列腺癌細(xì)胞表達(dá)前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen,PSA）的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了含有嗎啉酰脲基修飾的六肽結(jié)構(gòu)（Mu-HSSKLY）的1,3,4-三乙?；?N-疊氮乙酰甘露糖胺（Ac3ManNAz），該非天然糖分子達(dá)到前列腺癌細(xì)胞附近時(shí)其多肽結(jié)構(gòu)可被PSA水解，從而釋放Ac3ManNAz 進(jìn)入前列腺癌細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)行特異性標(biāo)記，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)組織的選擇性標(biāo)記。此外，基于腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞微環(huán)境的差異，比如酸堿度、活性氧和谷胱甘肽水平等的不同，尋求更多異質(zhì)性的靶向策略用于體內(nèi)活體特異性標(biāo)記腫瘤細(xì)胞依然是此領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向[51]。

3.3 利用糖工程人工載體策略

研究人員開發(fā)了殼聚糖、脂質(zhì)體、微管等不同類型的納米材料來包裝和運(yùn)輸糖代謝標(biāo)記相關(guān)非天然糖分子，以期實(shí)現(xiàn)非天然糖探針分子的靶向性[52-54]。LEE 等[55]用乙二醇?xì)ぞ厶羌{米材料包裝Ac4ManAz，通過尾靜脈注射可以提升其增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect,EPR），進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞膜表面的疊氮基標(biāo)記，隨后通過尾靜脈注入納米載藥顆粒使之與疊氮基發(fā)生非銅介導(dǎo)的生物正交反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)藥物的靶向運(yùn)輸。該策略可以對(duì)任何腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記，從而增強(qiáng)體內(nèi)腫瘤靶向治療效果，另外還可以通過對(duì)納米材料進(jìn)行修飾以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的特異性體內(nèi)標(biāo)記。例如，XIE等[56]通過葉酸修飾的脂質(zhì)體進(jìn)行非天然糖分子的包裝，可以靶向高表達(dá)葉酸受體的腫瘤細(xì)胞和組織并展現(xiàn)出了顯著的特異性標(biāo)記效果。另外，該課題組還通過用環(huán)狀多肽（Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys，cRGDyK）修飾的脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)對(duì)整合素αvβ3 陽(yáng)性的小鼠皮膚黑色素瘤B16F10 細(xì)胞的體內(nèi)特異性糖代謝標(biāo)記[57]。該策略也為細(xì)胞表面的其他配體或受體等靶向標(biāo)記提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，納米材料包裝和運(yùn)輸體系還可以結(jié)合超聲等物理手段實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)特異性標(biāo)記。WANG等[58]將包裹的Ac4ManAz 脂質(zhì)體與微泡相連，該共聚物經(jīng)血液運(yùn)輸，在生理?xiàng)l件下具有良好的穩(wěn)定性，通過對(duì)腫瘤局部的超聲使該共聚物分解破碎，釋放出的Ac4ManAz 通過腫瘤脈管系統(tǒng)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而特異性標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，該方法可明顯提升對(duì)腫瘤的特異性標(biāo)記效率，為原位腫瘤的示蹤、監(jiān)測(cè)和治療提供了新方法。

4 臨床應(yīng)用的展望

糖代謝標(biāo)記通過對(duì)腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞進(jìn)行修飾可以應(yīng)用于腫瘤靶向治療。其中，基于腫瘤細(xì)胞自身修飾，可以在腫瘤細(xì)胞表面人為添加上特異性抗原從而增加腫瘤細(xì)胞的靶向性。例如,可在腫瘤細(xì)胞表面添加已知的半抗原，即可以通過半抗原-載體激活抗腫瘤免疫。此外，還可以連接已上市的腫瘤特異性抗體藥物的抗原靶點(diǎn)分子，即可以改變?nèi)幮匀橄侔┑饶[瘤類型無藥可用的窘境；或者修飾特異性抗原，同時(shí)利用其配對(duì)抗體制備CAR-T 細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)個(gè)體化的腫瘤免疫治療等（圖2）。隨著T細(xì)胞及NK細(xì)胞免疫治療的發(fā)展，基于糖代謝標(biāo)記的T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞修飾可以為CAR-T、TCR-T 以及CARNK細(xì)胞治療提供更多的靶點(diǎn)選擇性。

圖2 糖代謝標(biāo)記在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用策略示意圖

糖代謝標(biāo)記在腫瘤靶向治療中的研究取得階段性成果，初步證明了糖代謝標(biāo)記應(yīng)用于腫瘤靶向治療的可能性，但是未來在臨床中的應(yīng)用仍然任重道遠(yuǎn)。目前，研究人員先后運(yùn)用腫瘤原位注射、腫瘤自身特異性酶類、靶向運(yùn)輸載體等方法提高非天然糖分子在腫瘤組織的體內(nèi)活體靶向標(biāo)記，但是仍然無法避免發(fā)生正常細(xì)胞的非特異標(biāo)記,因此設(shè)計(jì)并合成更高特異性的非天然糖分子是提高腫瘤細(xì)胞特異性標(biāo)記的關(guān)鍵。另外，對(duì)于非天然糖分子在正常小鼠體內(nèi)的分布及其代謝動(dòng)力學(xué)和不良反應(yīng)還缺乏系統(tǒng)的研究。如何提高體內(nèi)靶向腫瘤組織的特異性并實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用是該研究領(lǐng)域面臨的巨大挑戰(zhàn)，期待基于糖代謝標(biāo)記技術(shù)的腫瘤靶向治療策略能夠在臨床應(yīng)用中取得更大的突破。