尹情，韓俊淑，董稚明，郭煒，沈素朋，梁佳，路軍濤，郭艷麗（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院 河北省腫瘤研究所，河北石家莊 050011）

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過特異性靶向mRNA的3'-UTR抑制靶基因的表達和蛋白質翻譯。越來越多的證據(jù)表明，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。miR-452-5p 在多種腫瘤中均異常表達，如肺癌[1]、肝癌[2-3]、結腸癌[4]和腎細胞癌[5]等，并影響腫瘤的惡性進程，而食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell cancer，ESCC）中miR-452-5p的研究則罕有報道。LIU等[6]在食管癌芯片檢測中發(fā)現(xiàn)食管癌組織中miR-452-5p表達較癌旁組織明顯上調，但其在ESCC中的具體作用及機制并未闡明。本研究重點探討miR-452-5p對ESCC細胞增殖、侵襲能力的影響，及其在EMT過程中的生物學作用和潛在的分子機制，以期為ESCC的治療和預后評估提供新的候選標志物。

1 材料與方法

1.1 研究對象和主要試劑

收集2012 年3 月至2015 年12 月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院就診的86 名ESCC 患者的癌組織樣本和對應的癌旁組織。全部患者術前均未經(jīng)化療和放療。腫瘤組織切除術后，在20 min內(nèi)收集標本，一部分立即用液氮轉至-80 ℃低溫冰箱保存，用于提取RNA；另一部分進行石蠟包埋，常規(guī)H-E 染色，經(jīng)病理醫(yī)師診斷證實癌組織均為ESCC，癌旁組織均為食管正常黏膜組織。86例ESCC患者全部進行了隨訪，共有2 人失訪。本研究方案經(jīng)河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院倫理委員會審查通過（審批號：2019EMC012），所有入選患者均被告知并簽署知情同意書。

食管癌KYSE-150 細胞由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院生物樣本庫留存。TRIzol 購自Invitrogen 公司，逆轉錄試劑盒（FuGENE HD Transfection Reagent）購自Roche 公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、LipofectamineTM2000 轉染試劑、MTS 試劑均購自Promega 公司，RPMI 1640 培養(yǎng)基購自Gibco 公司，Transwell 小室及人工基膜（matrigel）購自Corning 公司，miR-452-5p mimic 購自GenePharma 公司，TOPFLASH、FOP-FLASH 質粒購自Millipore 公司，引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

KYSE-150細胞復蘇并培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的KYSE-150 細胞接種在6孔板中（2×105個/孔），待細胞生長匯合度至70%～80%時，按照LipofectanineTM2000 轉染試劑說明書分別將pcDNA3.1-SOX7、陰性對照（negative control，NC）或miR-452-5p mimic 及相應陰性對照（miR-NC）進行轉染，qPCR 驗證轉染效率；或將Wnt/β-catenin 信號通路特異性激活劑LiCl加入培養(yǎng)基處理KYSE-150 細胞，使其終摩爾濃度為20 mmol/L，同時換以20 mmol/L NaCl處理細胞作為陰性對照組。

1.3 qPCR法檢測miR-452-5p及其他相關基因的表達

按TRIzol 試劑說明書提取組織及KYSE-150 細胞中總RNA，SynergyHT 多模式微孔板檢測儀（美國Biotek 公司）測定總RNA 的濃度和純度。參照逆轉錄試劑盒說明將RNA 逆轉錄成cDNA，采用ABI7500 qPCR 儀檢測miR-452-5p、Wnt 通路相關基因及EMT 相關基因的表達，并分別以U6 或GAPDH基因作為內(nèi)參照。引物序列見表1。目的基因的相對表達量用2-△△Ct法計算。

表1 qPCR引物

1.4 MTS法檢測KYSE-150細胞的增殖能力

將KYSE-150細胞接種于96孔板中（3×103個/孔），每組設置6個復孔，分別于細胞貼壁后0、24、48 和72 h時在每孔中加入20 μL（500 μg/mL）MTS試劑，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，用酶標儀在490 nm波長處檢測每個孔的光密度（D）值。實驗重復3次。

1.5 Transwell法檢測KYSE-150細胞的侵襲能力

常規(guī)消化并懸浮KYSE-150 細胞于無血清培養(yǎng)基中，調整細胞密度接種于預鋪matrigel的上小室（1×105個/孔）內(nèi)，下小室內(nèi)加入600 μL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染色5 min，最后，在顯微鏡下（×200）隨機對5個視野的細胞進行拍照并計數(shù)。

1.6 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-452-5p 與SOX7的靶向關系

通過TargetScan 軟件預測miR-452-5p 與SOX7（SRY-box transcription factor 7，SOX7）之間存在的互補結合位點。將含有野生型（WT）SOX7 3'UTR的核苷酸片段克隆至pmirGLO 熒光素酶報告質粒載體。按照LipofectamineTM2000 轉染試劑說明書將野生型的pmirGLO-SOX7 與miR-452-5p-mimic 或miR-NC質粒共轉染KYSE-150細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞，用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。同時，為了檢測Wnt 通路活性，將TOP-Flash 或FOPFlash（TOP-Flash 突變體）與內(nèi)參照質粒pRLTK 一起轉染KYSE-150細胞，并于轉染48 h后用雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。結果以TOP/FOP比值表示，其中TOP值為轉染有TOP-Flash和內(nèi)參照質粒的樣本中采集得到的螢火蟲熒光值/海腎熒光值；FOP 值為轉染有FOP-Flash 和內(nèi)參照質粒的樣本中采集得到的螢火蟲熒光值/海腎熒光值。

1.7 統(tǒng)計學處理

所有實驗均獨立重復3 次。采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-452-5p在ESCC組織中呈高表達

qPCR 檢測結果顯示，ESCC 組織中miR-452-5p表達量明顯高于癌旁組織（P＜0.01，圖1A、B）。與癌旁組織相比，85.1%（74/86例）的ESCC患者癌組織中miR-452-5p 呈高表達（P＜0.01，圖1C）。UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）網(wǎng)站數(shù)據(jù)分析顯示，miR-452-5p在ESCC中表達明顯高于癌旁組織（均P＜0.01，圖1D），與本實驗檢測結果一致。

圖1 miR-452-5p在ESCC組織中呈明顯高表達

2.2 miR-452-5p 表達與ESCC 患者臨床病理特征和OS的關系

86 例ESCC 患者中，男性48 例、女性38 例；年齡39～78 歲，中位年齡57.6 歲；其中高、中分化ESCC 患者49例，低分化ESCC患者37例；有淋巴結轉移患者69例，無淋巴結轉移患者17例；依據(jù)美國癌癥聯(lián)合會臨床分期標準進行分期，其中Ⅰ、Ⅱ期患者41例，Ⅲ、Ⅳ期患者45 例。根據(jù)臨床病理特征進行分組比較，miR-452-5p 表達水平與ESCC 患者的淋巴結轉移及TNM 分期有關（P＜0.05），而與患者的年齡、性別、病理分級無關（P＞0.05，圖2A）。

應用Log-Rank 法分析miR-452-5p 表達高低對ESCC患者5年OS的影響，miR-452-5p表達的高低以均值為分界點進行分組，其中高表達組47例、低表達組39例。分析結果顯示，低表達組患者的5年OS為23.1%（中位OS為34個月），高表達組患者5年OS為9.2%（中位OS 為23 個月）。Log-Rank 檢驗分析結果（圖2B）顯示，miR-452-5p高表達患者的5年OS明顯低于低表達患者的5年OS（χ2=5.285，P=0.022）。

圖2 ESCC組織中miR-452-5p表達與臨床病理特征（A）和OS（B）的關系

2.3 miR-452-5p過表達促進KYSE-150細胞的增殖、侵襲能力及EMT進程

qPCR 驗證miR-452-5p mimic 轉染效果，結果顯示轉染組miR-452-5p 表達明顯高于相應陰性對照（miR-NC）（P＜0.01）。MTS 法、Transwell 實驗檢測結果顯示，與miR-NC 對照組相比，miR-452-5p mimic轉染組KYSE-150 細胞的增殖（P＜0.01，圖3A）及侵襲能力（P＜0.05，圖3B）明顯增強。qPCR法檢測結果（圖3C）顯示，轉染miR-452-5p mimic 促使KYSE-150細胞中上皮標志物E-cadherin 的表達水平明顯下調（P＜0.01），而間質標志物N-cadherin、SNAI1 及VIM表達水平明顯上調（P＜0.05或P＜0.01）。以上結果提示，miR-452-5p 促進KYSE-150 細胞的增殖、侵襲能力及EMT進程。

圖3 miR-452-5p對食管癌KYSE-150細胞增殖（A）、侵襲能力（B，×200）及EMT相關基因表達（C）的影響

2.4 miR-452-5p靶向調控SOX7基因并抑制其表達

為進一步明確miR-452-5p發(fā)揮生物學功能的可能機制，運用多個生物信息學數(shù)據(jù)庫（miRDB、TargetScan7.1 和miRWalk）預測miR-452-5p 潛在的靶基因。取評分較高的前30%的基因進行交集，共得9 個基因（圖4A），其中SOX7 被報道與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，本研究選取SOX7基因進行下一步研究。圖4B展示了SOX7與miR-452-5p的結合位點。在KYSE-150細胞中轉染miR-452-5pmimic后，發(fā)現(xiàn)可明顯降低SOX7基因的表達水平（P＜0.01，圖4C）；雙熒光素酶報告基因實驗結果也顯示miR-452-5p的過表達明顯降低了熒光素酶活性（P＜0.01，圖4D）。上述結果表明，miR-452-5p 通過直接結合SOX7 基因的3'-UTR 區(qū)抑制SOX7 基因的表達，即SOX7是miR-452-5p的直接靶基因。

圖4 miR-452-5p靶向SOX7基因并抑制其表達

2.5 miR-452-5p 通過靶向調控SOX7 基因的表達增強了Wnt/β-catenin信號通路的活性

有文獻[7]指出SOX7 是Wnt/β-catenin 信號通路的抑制因子之一，所以本研究要進一步探索miR-452-5p在Wnt信號轉導中的作用。應用經(jīng)典TOP/FOP-Flash報告基因系統(tǒng)來評估Wnt/β-catenin信號通路的活性，結果表明，與對照細胞相比，過表達miR-452-5p顯著增強了KYSE-150 細胞中Wnt/β-catenin 信號通路的活性（P＜0.01，圖5A）；而SOX7 的過表達可導致TOP/FOP熒光素酶活性降低（P＜0.01，圖5B）。此外，qPCR 結果顯示，miR-452-5p mimic 明顯上調了Wnt通路靶基因MYC、MMP-7 和CyclinD1 的表達（均P＜0.01；圖5C）；而SOX7 的過表達則部分抑制了miR-452-5p 對靶基因的上調作用（P＜0.05 或P＜0.01；圖5C）。以上結果表明miR-452-5p 靶向SOX7 抑制了Wnt/β-catenin信號通路的活性。

圖5 miR-452-5p靶向SOX7基因并抑制Wnt/β-catenin通路活化水平

2.6 miR-452-5p表達受Wnt/β-catenin通路活化水平的影響

PROMO網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn)，miR-452-5p啟動子區(qū)有多個TCF4/LEF1轉錄因子的結合位點（圖6A）。應用Wnt 通路激活劑LiCl 處理KYSE-150 細胞6、12 及24 h，NaCl處理作為對照組，TOP/FOP熒光素酶活性分析表明，隨著LiCl處理時間的增加，TOP/FOP熒光素酶活性比值（均P＜0.01，圖6B）及miR-452-5p的表達量也隨之增加（P＜0.05 或P＜0.01，圖6C），SOX7 的表達卻隨著LiCl 處理時間的增加而下降（P＜0.05 或P＜0.01；圖6C）。提示miR-452-5p 在靶向調控Wnt 信號通路的同時也受Wnt 通路活化水平的影響，其可能為Wnt/β-catenin通路的下游靶基因，即形成了miR-452-5p/SOX7/Wnt/miR-452-5p正反饋環(huán)路。

圖6 miR-452-5p表達受Wnt/β-catenin通路活化水平的影響

3 討論

ESCC是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，深入了解ESCC發(fā)生發(fā)展的分子機制有利于尋找更安全、更有效的治療靶點。近年來，大量研究表明miRNA可作為癌基因或抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。miR-452-5p的異常表達及其作用已在多種惡性腫瘤被報道，在肝細胞癌中miR-452-5p可以促進癌細胞的浸潤和轉移[8-9]；miR-452-5p的高表達與腎癌的不良預后密切相關[10]；在尿路上皮癌中發(fā)現(xiàn)，miR-452-5p在轉移陽性淋巴結中高表達，提示其具有促進轉移的作用[11]。然而，在胰腺癌[12]、乳腺癌[13]中，miR-452-5p則表現(xiàn)為對腫瘤的抑制?？梢?，miR-452-5p的生物學功能具有很強的腫瘤特異性。本研究發(fā)現(xiàn)miR-452-5p在ESCC癌組織中的表達顯著升高，與在UALCAN數(shù)據(jù)庫中分析miR-452-5p在ESCC中高表達的結果一致。在探討miR-452-5p表達與ESCC 臨床病理特征之間的關系時發(fā)現(xiàn)，miR-452-5p高表達與ESCC患者的淋巴結轉移和TNM 分期密切相關。體外功能學實驗結果顯示，miR-452-5p過表達明顯促進了ESCC細胞的增殖及侵襲能力。此外，Kaplan-Meier分析表明，miR-452-5p高表達與ESCC患者的不良預后密切相關。以上結果均提示，miR-452-5p可能在ESCC侵襲、轉移等惡性進程中扮演著重要的角色，并可能是ESCC患者預后不良的潛在預測因子。

EMT是癌細胞失去上皮表型并獲得間充質表型的過程，已被證實會導致腫瘤細胞的遷移和侵襲。為進一步明確miR-452-5p可促進ESCC侵襲性臨床表型的潛在分子機制，本研究首先檢測了miR-452-5p對EMT進程的影響，結果顯示miR-452-5p過表達明顯降低了上皮標志物的表達水平，而上調了間質標志物的表達，提示miR-452-5p促進了ESCC的EMT進程。接下來，進一步探討了miR-452-5p促進ESCC EMT 進程的可能分子機制。通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)，SOX7 基因3'UTR 區(qū)與miR-452-5p 有潛在的結合位點，并通過實驗證明了SOX7是miR-452-5p的直接靶基因。研究指出SOX7在多種腫瘤中通過抑制Wnt/β-catenin通路發(fā)揮抑癌基因的作用，例如腦膠質瘤[14]、腎細胞癌[7]、卵巢癌[15]、結直腸癌[16]、前列腺癌[17]等。Wnt/β-catenin通路調控細胞的許多生命過程，該通路的異?；罨贓MT 進程中發(fā)揮著重要作用[18]。Wnt/β-catenin信號通路在異常活化時，通路的中心因子β-catenin由胞質易位于細胞核，與LEF/TCF轉錄因子家族結合，調節(jié)下游靶基因的轉錄[19-21]；而SOX7可與TCF競爭結合β-catenin，從而阻斷了β-catenin-TCF 介導的基因轉錄激活，遏制Wnt/β-catenin通路的活性[7，17]。SOX7對Wnt/β-catenin信號通路的拮抗作用促使本研究進一步探索了miR-452-5p在Wnt信號通路中的作用。TOP/FOP熒光素酶分析及Wnt通路靶基因檢測結果顯示，miR-452-5p通過對SOX7基因的抑制作用明顯提高了Wnt通路活性。同時，實驗中發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，在應用Wnt通路激活劑LiCl處理細胞時，隨著處理時間的增加，熒光素酶活性及miR-452-5p的表達量也隨之增加，而SOX7的表達量則隨之下降。進一步結合轉錄因子預測網(wǎng)站PROMO數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)在miR-452-5p啟動子區(qū)有多個TCF4/LEF1 轉錄因子的結合位點，β-catenin與TCF/LEF轉錄因子結合促進下游靶基因的轉錄是Wnt通路活化的經(jīng)典模式。以上研究結果提示，miR-452-5p在靶向激活Wnt/β-catenin信號通路的同時，其本身也受Wnt/β-catenin通路活化影響，其自身可能為Wnt/β-catenin通路的下游靶基因。miR-452-5p表達的變化進一步通過對SOX7的靶向調控影響了Wnt 信號通路的活化水平，即形成了miR-452-5p/SOX7/Wnt/miR-452-5p正反饋環(huán)路。

綜上，本研究揭示了miR-452-5p在ESCC組織中表達明顯上調。miR-452-5p 的高表達促進了食管癌KYSE-150 細胞的增殖、侵襲能力及EMT 進程。miR-452-5p 通過miR-452-5p/SOX7/Wnt/miR-452-5p正反饋環(huán)路提高了Wnt/β-catenin通路活化水平，進而促進KYSE-150 細胞的EMT 進程。miR-452-5p 有望為ESCC患者的治療提供潛在分子靶點，同時也為預后評估提供一種新的標志物。