王 巖 商文靜 韓鋒產(chǎn)

濱州醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，山東省醫(yī)藥衛(wèi)生耳科遺傳病重點實驗室 山東 煙臺 264003

Fscn2是Fascin家族的一員，F(xiàn)scn2可與F-actin交聯(lián)成剛性平行的纖毛束[1]。Perrin等[2]研究DBA/2J增齡性聾小鼠發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)scn2與β-actin相互作用維持了小鼠的靜纖毛長度和聽覺功能。Yang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，DBA/2J小鼠耳蝸細胞凋亡導致其早期聽力減退，通過抗凋亡治療可減輕耳蝸細胞的凋亡。敲低Fscn2基因增加了腎小管上皮細胞對順鉑誘導細胞凋亡的易感性。Fscn2在C2細胞【敲低α(E-Catenin的NRK-52E細胞)】中的過表達降低C2細胞對順鉑誘導細胞凋亡的敏感性[4]。這些研究表明，F(xiàn)scn2不僅是一種結(jié)構(gòu)蛋白，還具有調(diào)節(jié)細胞命運的功能。

順鉑是一種高效的抗腫瘤藥物，廣泛應用于各種癌癥的治療，包括頭頸部癌、胃癌等[5]。但在接受順鉑化療后，約40%～80%的成人和至少50%的兒童出現(xiàn)永久性的聽力損失[6]。順鉑的耳毒性在臨床上主要表現(xiàn)為雙側(cè)、漸近性和不可逆的感音性神經(jīng)聽力損失[7]。本研究旨在探討Fscn2基因的過表達對順鉑誘導耳蝸細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HEI-OC1(house ear institute-organ of corti 1)耳蝸細胞來自豪斯耳科學研究所(House Ear Institute)。血清購自Gibco公司(貨號為16140-071)；高糖購自Hyclone公司(貨號為SH30023.01)；嘌呤霉素購自Meilunbio公司(貨號為MA0318)；Rabbit Anti Bcl-2 antibody購自Proteintech公司(貨號為26593-1-AP)；FITC-Annexin V試劑盒購自BD公司(貨號為556547)；Anti C-caspase3 antibody購自CST公司(貨號為9505)。

1.2 實驗方法

1.2.1 慢病毒感染耳蝸細胞 構(gòu)建表達Fscn2病毒載體(主要原件見表1)包裝慢病毒顆粒。培養(yǎng)HEI-OC1細胞(33℃，10% CO2)，當貼壁率達到30%～40%時可進行慢病毒感染。將細胞培養(yǎng)液、慢病毒、慢病毒感染增強液按照989∶10∶1的比例混勻，配制成慢病毒感染培養(yǎng)液。以換液形式加入六孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出，棄除慢病毒感染培養(yǎng)液，1×PBS清洗2次，加入細胞培養(yǎng)液(2 mL/孔)。培養(yǎng)48 h后，加入含6 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)液篩選得到Fscn2穩(wěn)定表達株。

表1 Fscn2病毒載體結(jié)構(gòu)

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖率 構(gòu)建外源性Fscn2過表達載體，包裝病毒顆粒，感染耳蝸細胞，獲得Fscn2過表達的耳蝸細胞模型(以下簡稱為Fscn2-o/e細胞)。同樣方法獲得對照組細胞，即E.V.細胞。收集E.V.細胞和Fscn2-o/e細胞并計數(shù)，按5 000細胞/孔加入96孔板中，補培養(yǎng)液至100 μL，混勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸掉96孔板中的培養(yǎng)液并用PBS洗2次。以換液的方式加入含有順鉑的培養(yǎng)液，順鉑濃度為30 μM。培養(yǎng)24 h后，配置含10%WST-8【化學名為2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽】的培養(yǎng)液，以換液的形式加入96孔板(100 μL/孔)。設置空白孔，只含10% WST-8的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱2 h后，96孔板放入酶標儀中，測定順鉑干預的E.V.細胞和Fscn2-o/e細胞在450 nm處吸光度并計算細胞存活率。細胞存活率=順鉑干預細胞的OD值/順鉑未干預的細胞的OD值。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 進行E.V.細胞和Fscn2-o/e細胞培養(yǎng)，收集細胞，離心去上清，加入1 mL培養(yǎng)液重懸細胞。六孔板每孔加300 μL細胞懸液，再加700 μL培養(yǎng)液混勻細胞，放入培養(yǎng)箱。待E.V.細胞和Fscn2-o/e細胞長滿，以換液的方式加入含有順鉑的培養(yǎng)液，順鉑濃度為30 μM。培養(yǎng)24 h后，收集細胞(包括懸液中的細胞)，按 1∶9 稀釋結(jié)合緩沖液得到1×結(jié)合緩沖液。用1×結(jié)合緩沖液懸浮E.V.細胞和Fscn2-o/e細胞，調(diào)節(jié)其濃度約為1×106/mL。分別取100 μL的E.V.細胞和Fscn2-o/e細胞懸液于2 mL EP管中，加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI混勻，室溫避光孵育15 min。加入400 μL PBS，轉(zhuǎn)移至5 μL 流式管中立刻放入流式細胞儀(Bekmancoulter EPICS-XL,美國)進行流式細胞檢測。

1.2.4 Western Blot 將E.V.細胞和Fscn2-o/e細胞接種到6孔板。待E.V.細胞和Fscn2-o/e細胞長滿后(約24 h)，以換液的方式加入含有30 μM順鉑的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，收集E.V.細胞和Fscn2-o/e細胞加入裂解液(PMSF∶RIPA=1∶100)80 μL，靜置10 min，震蕩15 s。在4 ℃下，12 000 r/min離心15 min，收集上清。BCA法測定蛋白濃度，計算上樣量。配制10%的SDS-PAGE凝膠，分別將順鉑干預的E.V.細胞蛋白樣品和Fscn2-o/e細胞蛋白樣品加入梳孔中，電壓設置為110 V進行電泳120 min。將蛋白樣品轉(zhuǎn)到PVDF膜上，電流為200 mA，時間為110 min。將PVDF膜放入封閉液中，封閉2 h。一抗(抗Fscn2、Bcl-2、Cleaved caspase-3的抗體)用TBST稀釋。將一抗稀釋液加入密封袋中，放入PVDF膜，封口，4℃搖床上孵育過夜。第二天將膜取出，用TBST快速洗10 min，重復3次，用TBST將按照1∶5 000的比例稀釋二抗，室溫搖床慢速孵育2 h，用ECL化學發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1Fscn2過表達耳蝸細胞模型的鑒定 Western blot對構(gòu)建的Fscn2過表達耳蝸細胞進行驗證，結(jié)果顯示，F(xiàn)scn2-o/e細胞的Fscn2蛋白的表達量高于E.V.細胞(圖1)。

兩組比較，**P<0.01。

2.2Fscn2過表達耳蝸細胞增殖能力的檢測 構(gòu)建細胞模型后，用順鉑進行干預。結(jié)果顯示，在30 μM的順鉑干預24 h之后，與E.V.細胞比較，F(xiàn)scn2-o/e細胞的增殖能力顯著增強，P<0.01(圖2)。

兩組比較，**P<0.01。

2.3Fscn2過表達耳蝸細胞凋亡率的檢測 用30 μM順鉑處理Fscn2-o/e細胞與E.V.細胞24 h，再用流式細胞術檢測細胞凋亡。結(jié)果顯示，在順鉑干預下，E.V.細胞的Q2(早中期凋亡細胞)區(qū)域細胞占比為12.8 %，Q4(晚期凋亡細胞)區(qū)域細胞占比為12 %，而Fscn2-o/e細胞Q2區(qū)域細胞占比為7.4%，Q4區(qū)域細胞占比為9.3 %(圖3A)。統(tǒng)計分析顯示，在順鉑干預后，E.V.細胞與Fscn2-o/e細胞的凋亡率比較，P<0.01(圖3B)。本研究提示，F(xiàn)scn2的過表達能顯著抑制順鉑所致的耳蝸細胞凋亡。

A為流式細胞術檢測細胞凋亡率；

2.4 Western blot檢測Fscn2過表達耳蝸細胞凋亡相關蛋白的表達 為進一步研究在順鉑干預下Fscn2過表達耳蝸細胞凋亡率降低的機制，本研究通過Western blot對凋亡相關蛋白進行檢測。結(jié)果顯示，30 μM順鉑干預24 h后，與E.V.細胞相比，F(xiàn)scn2-o/e細胞抗凋亡相關蛋白Bcl-2的表達較高，而凋亡相關蛋白Cleaved caspase3水平較低(圖4)。本研究提示，F(xiàn)scn2-o/e細胞可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Cleaved-caspase3的水平以對抗順鉑誘導的細胞凋亡。

兩組比較，*P<0.05。

3 討論

順鉑誘導耳毒性的詳細機制尚不完全清楚，目前認為包括DNA損傷、活性氧(reactive oxygen species，ROS)過量生成和細胞凋亡在內(nèi)的多種機制與此有關[8-9]。順鉑進入細胞后，造成DNA損傷[10]，引起毛細血管擴張性共濟失調(diào)癥突變(ataxia-telangiectasia mutated，ATM)。ATM可以激活腫瘤抑制基因p53，增加促凋亡相關蛋白Bax的表達，后者增加線粒體膜的通透性，使細胞色素C從線粒體釋放，導致caspase 3的活化[11]。用30 μM的順鉑干預24 h后，HEI-OC1細胞的存活率下降約50%，Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)的表達降低。用Nrf2激活劑—叔丁基氫醌(tertiary butylhydroquinone，TBHQ)對細胞進行處理，細胞中非線粒體ROS的積累減少，抑制了細胞的凋亡[12]。此外，α-硫辛酸(alpha lipoic acid，ALA)、海藻糖、小檗堿或黃連素等小分子藥物可抑制順鉑誘導的耳蝸細胞凋亡[13-15]。

順鉑可通過誘導細胞凋亡通路發(fā)揮其耳毒性[16]。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methyltransferase，PRMT3)和大麻素系統(tǒng)的相互作用與順鉑誘導的耳毒性有關，PRMT3和大麻素系統(tǒng)的相關蛋白脂肪酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH1)的過表達調(diào)控順鉑誘導的HEI-OC1細胞凋亡相關蛋白的水平(如Cleaved-caspase3的表達升高)[17]。順鉑還可通過使脂質(zhì)過氧化物、鐵元素的堆積以及線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的下降以誘導HEI-OC1細胞的鐵死亡，最后引起細胞凋亡[18]。鐵死亡的抑制劑ferrostatin-1能夠改善順鉑誘導的HEI-OC1細胞凋亡以及耳蝸外植體中線粒體的功能[19]。在順鉑干預下，注射了AAV2-Pou4f3 shRNA的小鼠耳蝸中凋亡相關蛋白Bax水平升高，而抗凋亡相關蛋白Bcl-2水平降低。這提示，在順鉑處理后，Pou4f3的低表達可能增加耳蝸細胞的凋亡[20]。使用氯喹阻斷自噬可以改善順鉑誘導的HEI-OC1細胞的鐵死亡，這表明，通過鐵死亡誘導的細胞死亡與細胞的過度自噬有關[21]。Fscn2還能改善順鉑所致的腎小管上皮細胞的凋亡[22]。

綜上所述，為進一步研究Fscn2的過表達是否抑制順鉑誘導的耳蝸細胞凋亡，本研究構(gòu)建了Fscn2過表達的耳蝸細胞模型。本研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑的干預下，F(xiàn)scn2-o/e細胞的增殖能力較高，而細胞凋亡的水平較低，凋亡相關蛋白表達水平較低。這表明，F(xiàn)scn2基因的過表達抑制了順鉑誘導的耳蝸細胞凋亡，F(xiàn)scn2可能是對抗順鉑誘導耳蝸細胞凋亡的重要因素之一，但詳細機制有待進一步研究。本研究利用Fscn2基因過表達的細胞模型探討Fscn2對順鉑誘導耳蝸細胞凋亡的影響，為揭示Fscn2基因的功能提供實驗依據(jù)。