班晨方， 王佐林

（上海市牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，上海 200072）

種植體良好的骨結(jié)合是種植修復(fù)長期穩(wěn)定的保證。 目前，口腔種植領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究主要聚焦于種植體植入后的早期骨改建過程，以期提高種植體的骨結(jié)合能力[1-2]。 制備種植窩是種植修復(fù)的起始，使用微創(chuàng)手術(shù)的理念減小對周圍骨組織的破壞，有利于早期骨組織的改建，保障種植體形成穩(wěn)定的骨結(jié)合。 Eriksson 等[3]認(rèn)為，超過47 ℃持續(xù)1 min 的熱傳導(dǎo)將對骨組織產(chǎn)生不可逆的熱損傷。 熱損傷將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，延遲周圍骨組織的新骨生成，甚至使其無法與種植體形成骨結(jié)合[4]。

使用冷卻液是降低備孔區(qū)溫度的重要措施[5]，臨床手術(shù)中通常使用0.9%氯化鈉溶液作為冷卻液，但是使用預(yù)冷（4 ℃）還是常溫（20 ℃）的冷卻液仍存在爭議[6-8]。 此外，有學(xué)者的研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在輕度升溫（39~41 ℃）的條件下可促進(jìn)成骨分化，表現(xiàn)出更強的礦化能力[9-10]。因此，探究種植窩制備過程中的產(chǎn)熱機制及冷卻措施、控制備孔區(qū)的溫度變化在安全范圍內(nèi)，均對減少周圍骨組織的損傷、促進(jìn)種植體周早期骨改建及骨結(jié)合具有重要意義。 先前的研究主要使用人造骨或牛股骨等長骨進(jìn)行體外種植窩制備產(chǎn)熱的探究，與常規(guī)口腔環(huán)境及骨骼類型存在區(qū)別。 本實驗建立了大鼠上頜磨牙區(qū)種植窩制備模型，通過有限元熱傳導(dǎo)模型對備孔區(qū)骨組織的溫度分布進(jìn)行分析，探討不同溫度（4 ℃、20 ℃、40 ℃）冷卻液對備孔區(qū)骨組織溫度的影響和備孔區(qū)損傷情況；探究早期過程中備孔區(qū)組織的破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的活躍程度，比較早期骨改建過程的差異。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級4 周齡雄性SD 大鼠48 只，體質(zhì)量（100±10） g，飼養(yǎng)于同濟大學(xué)附屬口腔醫(yī)院實驗動物中心。 將大鼠編號后隨機分為3 組，根據(jù)術(shù)中使用0.9%氯化鈉溶液的溫度分別命名為4 ℃組、20 ℃組、40 ℃組。

1.1.2 實驗設(shè)備 牙科種植機MD20 （NOUVAG 公司，瑞士）；K 型電熱偶（優(yōu)利德公司，中國）； UT321測溫儀（優(yōu)利德公司，中國）；恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司，中國）；種植鉆針（直徑1.6 mm；上海嶺之崎精密工具技術(shù)有限公司， 中國）; mirco-CT 機（Scanco 公司，瑞士）；NanoDrop 超微量紫外-可見光分光光度計（Thermo Fisher 公司，美國）。

1.1.3 軟件 有限元分析軟件ANSYS 19.2（ANSYS公司，美國）；統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0（IBM 公司，美國）。

1.1.4 試劑 包埋石蠟（萊卡公司，德國）；RNA 提取試劑盒Rneasy Mini Kit （Qiagen 公司， 德國）；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（Roche 公司， 瑞士）；Runx2-ab192256 抗體（Abcam公司，英國）；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI；Thermo Fisher 公司,美國）；TRAP 染色試劑盒（Sigma 公司， 美國）； 熒光二抗（Abcam 公司，英國）；甲基綠染液（生工公司，中國）；0.9%氯化鈉溶液（中國醫(yī)藥集團有限公司，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠建模 將4 周齡大鼠隨機分為4 ℃、20 ℃、40 ℃3 種冷卻液組，用3%戊巴比妥鈉（10 mL/g）腹腔注射麻醉后，拔除大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙，愈合4 周后，進(jìn)行動物體內(nèi)實驗建模。 大鼠術(shù)前12 h 禁食，不禁水，使用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（0.1 mL/100 g），將大鼠仰臥位固定于大鼠操作臺，術(shù)區(qū)用碘伏消毒，于雙側(cè)上頜第一磨牙區(qū)切開翻瓣后，使用球鉆進(jìn)行種植位點定位，隨后于種植位點近中相距1.8 mm 處使用手用鉆制備垂直牙槽骨直徑0.35 mm、深2 mm 的測溫孔， 插入K 型熱電偶傳感器后并使用骨蠟密封和固定。使用鉆針直徑為1.6 mm 的種植機于定位點進(jìn)行種植窩洞預(yù)備，種植機參數(shù)設(shè)定為1 000 r/min，扭矩為35 N/cm，冷卻液流速為10 mL/min，制備時間為20 s。將術(shù)中的3 組0.9%氯化鈉冷卻液分別放置于在4 ℃、20 ℃、40 ℃水浴鍋中保持溫度恒定。術(shù)中使用K 型熱電偶實時記錄測溫孔的溫度變化。 手術(shù)完成后，壓迫止血，使用6-0 外科縫線縫合創(chuàng)口，術(shù)后進(jìn)食軟食3 d。

1.2.2 RNA 提取和相關(guān)基因表達(dá)測定 常規(guī)處死大鼠，剝離軟組織后取雙側(cè)上頜骨，將其裁剪為種植窩周圍6 mm×6 mm×2 mm 大小的骨塊，使用4 ℃1×PBS 溶液沖洗3 次，放入研缽中加入液氮充分冷卻后研磨為粉末， 在每100 mg 骨粉加入1 mL TRIzol試劑裂解后，使用RNA 提取試劑盒提取RNA，使用超微量紫外-可見光分光光度計測量RNA 濃度及純度后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成獲得cDNA，熒光定量PCR 儀檢測相關(guān)基因表達(dá)水平， 所用引物序列見表1。

表1 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)引物序列Table 1 Real-time quantitative polymerase chain reaction (RTqPCR) primer sequence

1.2.3 有限元分析 使用ANSYS APDL 軟件內(nèi)置的Plane 55 號單元，模擬種植窩周圍縱切面骨塊的二維模型。 建立高度和寬度分別為2、1 mm 的區(qū)域，劃分為0.01 mm×0.01 mm 的網(wǎng)格， 設(shè)定鉆頭給進(jìn)速度為0.1 mm/s，20 s 后熱載荷失效。 求解后獲得溫度分布場，所用材料參數(shù)：骨組織熱導(dǎo)率為0.6 W/（m·K）；骨密度為1 800/（kg·m-3）；骨比熱為1 260 J/（kg·K）[11]。

1.2.4 石蠟切片及免疫熒光 用4%多聚甲醛灌流固定待取材大鼠，剝離軟組織后取上頜骨，使用4%多聚甲醛溶液4 ℃下固定24 h 組織脫鈣處理，組織脫水，石蠟包埋，石蠟切片機制作厚度為3 μm 連續(xù)的石蠟切片。 脫蠟完成后進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、TUNEL 染色及Runx2 免疫熒光染色，在顯微鏡下觀察，相同放大倍率隨機視野下記錄陽性細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 備孔區(qū)有限元熱傳導(dǎo)模型結(jié)果

建立有限元熱傳導(dǎo)模型后，根據(jù)3 組冷卻液溫度（4 ℃、20 ℃、40 ℃）進(jìn)行求解計算后獲得對應(yīng)的備孔區(qū)溫度場分布情況，選取距離種植窩洞壁1 mm、深2 mm 處的溫度與該組對應(yīng)的熱電偶實測溫度進(jìn)行對比（表2），證明所設(shè)計的有限元模型擬合度較好，能匹配3 種冷卻水溫下的溫度變化。

表2 大鼠體內(nèi)實驗測溫孔溫度變化測量值與有限元模型模擬值對比Table 2 Comparison of the temperature change in thermometric holes in vivo and the simulated values of the finite element model

獲取3 組溫度變化最大時，備孔區(qū)溫度分布情況（圖1A—C），4 ℃組和20 ℃組的備孔區(qū)骨組織溫度都低于體溫37 ℃，越靠近中心，冷卻效果越佳；40 ℃組備孔區(qū)骨組織溫度皆高于體溫37 ℃， 溫度最高點位于窩洞中心的鉆針處， 高于40 ℃的區(qū)域約為距窩洞中央600 μm 內(nèi)。 3 組窩洞中心溫度隨時間變化的結(jié)果見圖1D，4 ℃組冷卻效果最佳， 且冷卻速度最快，最低可降至16.1 ℃；20 ℃組冷卻效果弱于4 ℃組， 最低可降至26.9 ℃；40℃組全程高于37 ℃，并在17~20 s 時超過42 ℃，最高溫度達(dá)42.9 ℃。

2.2 備孔區(qū)周圍骨組織損傷情況

細(xì)胞在熱損傷的情況下會產(chǎn)生凋亡現(xiàn)象，通過對術(shù)后組織凋亡情況的觀察可以比較不同冷卻溫度下的組織損傷情況。 術(shù)后1 d， 組織細(xì)胞凋亡TUNEL 染色結(jié)果（圖2A—I）顯示，3 組的細(xì)胞凋亡主要分布于靠近窩洞中央的區(qū)域，40 ℃組的凋亡細(xì)胞分布范圍較其余2 組廣泛； 凋亡細(xì)胞計數(shù)結(jié)果（圖2J）顯示，40 ℃組骨組織損傷最為嚴(yán)重，凋亡細(xì)胞數(shù)量最多（P＜0.05）；結(jié)合有限元溫度分布情況（圖1A—C）， 細(xì)胞凋亡分布與高溫區(qū)域分布一致。當(dāng)組織得到充分冷卻后，備孔區(qū)最高溫度皆在熱損傷溫度閾值以下， 如20 ℃組和4 ℃組，2 組備孔區(qū)細(xì)胞損傷情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2J）。術(shù)后1 d 的RT-qPCR 結(jié)果（圖2K）顯示，3 組Hsp70的轉(zhuǎn)錄水平未見明顯差異（P＞0.05，圖2K）。

圖1 有限元模擬3 組備孔區(qū)溫度分布情況Figure 1 Finite simulation of temperature distribution in three groups of socket preparation areas

圖2 備孔區(qū)周圍骨組織的細(xì)胞凋亡結(jié)果(×100)Figure 2 Cell apoptosis results of the bone tissue around the socket preparation area (×100)

2.3 種植窩周圍骨組織形態(tài)學(xué)變化

TRAP 染色比較3 組早期骨改建過程中破骨細(xì)胞的活躍情況（圖3A—I）。 術(shù)后4 d 的TRAP 染色結(jié)果（圖3A、D、G）顯示，40 ℃組破骨細(xì)胞激活數(shù)量多于其余2 組（P＜0.05，圖3J），且分布范圍大于其余2 組；術(shù)后7 d 的結(jié)果（圖3B、E、H）顯示,備孔區(qū)破骨細(xì)胞激活數(shù)量和范圍都減弱，3 組破骨細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后14 d 的破骨細(xì)胞主要活躍于種植窩區(qū)域，種植窩內(nèi)新生骨骨髓腔大于周圍骨組織，3 組破骨細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 3 組骨愈合過程中，未見軟骨組織，愈合過程為骨膜下成骨。

圖3 破骨細(xì)胞活躍情況(×100)Figure 3 Activity of osteoclasts (×100)

術(shù)后7 d， 備孔區(qū)Runx2 免疫熒光染色結(jié)果（圖4A、C、E）顯示，40 ℃組中Runx2 陽性細(xì)胞數(shù)量少于其余2 組（P＜0.05，圖4G），成骨細(xì)胞激活水平最低，在備孔區(qū)損傷較大的情況下，成骨作用出現(xiàn)了延遲，4 ℃組與20 ℃組成骨細(xì)胞激活水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 術(shù)后14 d 的結(jié)果（圖4B、D、F）顯示，3 組成骨細(xì)胞數(shù)量均繼續(xù)增長，且主要分布于骨表面，4 ℃組與20 ℃組成骨作用強于40 ℃組（P＜0.05，圖4G）。

圖4 成骨細(xì)胞活躍情況(×100)Figure 4 Activity of osteoblasts (×100)

術(shù)后14 d mirco-CT 分析結(jié)果（圖5）顯示，3 組窩洞區(qū)骨密度均明顯低于周圍牙槽骨，牙槽嵴頂和鼻底未見皮質(zhì)骨白線。4 ℃組與20 ℃的窩洞區(qū)基本愈合完整，4 ℃組的新生骨礦化程度最高，窩洞邊緣界限不清晰；40 ℃組種植窩中心未完全形成骨基質(zhì)，窩洞邊緣輪廓清晰。 新生骨組織骨密度測定結(jié)果顯示，4 ℃組高于40 ℃組（P＜0.05），但4 ℃組與20 ℃組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

目前，主要是基于大型動物進(jìn)行骨愈合及種植體研發(fā)的動物實驗，其存在樣本量小及時間點少的局限性。 隨著對嚙齒類動物如大鼠的研究深入，有學(xué)者認(rèn)為其骨愈合方式與大型動物類似，并且鼠骨的物理特性與人類骨質(zhì)沒有本質(zhì)區(qū)別[12-13]。 因此，本實驗使用大鼠建立種植窩制備模型能為臨床應(yīng)用提供一定的證據(jù)和參考。

早期研究人員廣泛使用紅外測溫儀對備孔區(qū)進(jìn)行溫度測定， 但該方法僅能測量組織表面的溫度，無法獲取組織內(nèi)部溫度。 而后，有學(xué)者將熱電偶插入組織內(nèi)部進(jìn)行溫度測量，該方法具有靈敏和穩(wěn)定性好的優(yōu)點，但依然存在無法獲取種植鉆針核心處骨組織溫度的局限。因此,本實驗引入有限元熱傳導(dǎo)模型， 并與熱電偶實測溫度進(jìn)行擬合匹配分析（表2）， 該模型能動態(tài)模擬記錄備孔區(qū)骨組織溫度變化，可為未來種植窩制備過程中溫度測量相關(guān)的研究提供參考。

種植窩洞制備完畢后，本實驗通過觀察早期不同時間點備孔區(qū)的組織形態(tài)學(xué)，分析3 組冷卻液的備孔區(qū)骨損傷和早期骨愈合情況的差異。 本實驗選取術(shù)后1 d 作為觀察備孔區(qū)骨損傷的時間點， 檢測備孔區(qū)凋亡細(xì)胞以評判損傷程度；術(shù)后4、7、14 d 時對備孔區(qū)進(jìn)行骨改建， TRAP 為破骨細(xì)胞的標(biāo)志酶， 通過TRAP 染色分析破骨細(xì)胞活躍程度。Wang 等[14]的研究表明，新生骨開始形成于術(shù)后7 d，Runx2 是成骨細(xì)胞分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，術(shù)后7 d 和14 d 采用Runx2 免疫熒光染色比較成骨細(xì)胞激活數(shù)量，探討激活成骨速度的優(yōu)劣；術(shù)后14 d 采用mirco-CT 對新骨的形態(tài)參數(shù)進(jìn)行分析，評價3 組骨愈合情況。

術(shù)后1 d 檢測Hsp70 表達(dá)水平（圖2K），3 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義， 結(jié)合40 ℃組的備孔區(qū)溫度分布圖（圖1C），備孔區(qū)靠近窩洞中央?yún)^(qū)域超過42 ℃，細(xì)胞凋亡主要集中于該處， 邊緣區(qū)域大部分維持在39~41 ℃。 溫度能影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化增殖[15]，超過47 ℃時將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3]，但在小幅度的升溫（39~41℃）環(huán)境下，持續(xù)1 h 能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[9-10,16-17]。 本實驗引入40 ℃0.9%氯化鈉溶液擬探究短時間（20 s）小幅度升溫是否可以在大鼠上頜種植窩制備模型過程中刺激成骨細(xì)胞分化，加速早期成骨。 熱應(yīng)激下機體會產(chǎn)生熱休克蛋白，其為一組高度保守且廣泛表達(dá)的蛋白質(zhì)，涉及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊、組裝和運輸?shù)冗^程，Hsp70 是熱休克蛋白最重要的成員之一，其可以激活ERK 和Wnt/β-catenin 信號通路促進(jìn)成骨[18]。 因此，本實驗認(rèn)為，制備過程中的短時間（20 s）無法激活Hsp70 以加強成骨作用； 術(shù)后1 d，40 ℃組的細(xì)胞凋亡數(shù)量高于其余2 組（圖2J），升溫超過42 ℃將導(dǎo)致備孔區(qū)熱損傷而發(fā)生細(xì)胞凋亡，本實驗結(jié)果與Chen 等[12]得出的閾值一致。

種植窩制備過程中，產(chǎn)熱的來源主要為鉆頭使骨屑剝離而形變產(chǎn)熱和鉆頭與骨屑及孔壁摩擦產(chǎn)熱[11]，機械損傷和熱損傷同時導(dǎo)致了備孔區(qū)的細(xì)胞凋亡。 本實驗采用相同轉(zhuǎn)速和直徑的鉆針進(jìn)行制備，因此，制備過程中的形變產(chǎn)熱相同，洞壁摩擦產(chǎn)熱量相同；使用相同的冷卻液流速，保證窩洞內(nèi)保留相同的骨屑量，骨屑摩擦的產(chǎn)熱量也相同[19]，因此，3 組冷卻液的冷卻效果差異導(dǎo)致了備孔區(qū)周圍骨損傷的差異。4 ℃組與20 ℃組冷卻下備孔區(qū)最高溫度（圖1A、B） 已低于相對保守的42 ℃細(xì)胞損傷閾值[12]，此時備孔區(qū)未發(fā)生熱損傷現(xiàn)象，故區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞凋亡是窩洞制備時機械切割的細(xì)胞損傷所導(dǎo)致的。 因此，在已經(jīng)達(dá)到充足的冷卻效果下，可以考慮采取如使用合適的轉(zhuǎn)速、改進(jìn)鉆針設(shè)計等措施[20-21]，降低備孔區(qū)骨組織的機械損傷，進(jìn)而提高種植修復(fù)的成功率。

術(shù)后的骨組織愈合過程中， 術(shù)后4 d TRAP 染色結(jié)果顯示，40 ℃組的破骨細(xì)胞數(shù)量最多（P<0.05），分布范圍最廣，對應(yīng)其備孔區(qū)損傷最嚴(yán)重，需要進(jìn)行改建的骨組織也最多；術(shù)后7 d 和14 d 成骨誘導(dǎo)因子Runx2 的免疫熒光染色結(jié)果顯示, 備孔區(qū)損傷較小的4 ℃組和20 ℃組表現(xiàn)出更高的成骨活躍水平,成骨細(xì)胞激活速度優(yōu)于40 ℃組；術(shù)后14 d 備孔區(qū)mirco-CT 分析顯示，4 ℃組愈合情況最佳， 窩洞區(qū)可見新生骨組織充盈完畢， 但嵴頂未見骨白線，新骨礦化程度最高，骨密度高于40 ℃組（P<0.05），但與20 ℃組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 因此，本實驗認(rèn)為，備孔區(qū)骨組織損傷程度較大時，早期骨愈合速度也會相應(yīng)減緩；4 ℃與20 ℃0.9%氯化鈉溶液冷卻后的備孔區(qū)在早期骨改建過程中未見愈合速度的差異。

綜上所述，本實驗通過構(gòu)建大鼠上頜磨牙種植窩制備模型，探究備孔區(qū)周圍骨組織損傷情況及早期愈合過程，表明使用合適溫度的冷卻液有助于減少制備過程中的骨組織損傷；在充足流量的冷卻液灌流下，4 ℃與20 ℃0.9%氯化鈉溶液的冷卻效果未見差異，早期骨愈合速度無差異。 上述結(jié)論可為未來手術(shù)操作提供參考。