宋思嘉， 陳文霞， 李賢玉

（廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，附屬口腔醫(yī)院，廣西顱頜面畸形臨床醫(yī)學(xué)研究中心，頜面外科疾病診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)口腔感染性疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

外泌體是一種雙層膜樣結(jié)構(gòu)囊泡， 直徑為50~150 nm，可由不同種類的細(xì)胞分泌，其參與調(diào)節(jié)包括腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫、炎癥、血管疾病、損傷修復(fù)等在內(nèi)的多種生理、病理過(guò)程[1]。 研究發(fā)現(xiàn)，在損傷修復(fù)過(guò)程中，多種組織或細(xì)胞來(lái)源的外泌體均能顯著促進(jìn)組織修復(fù)、減少瘢痕組織形成。 既往研究表明，多種不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可通過(guò)調(diào)節(jié)皮膚創(chuàng)面愈合過(guò)程中的炎癥反應(yīng)、 細(xì)胞增殖和遷移、血管生成、膠原沉積等多個(gè)階段，促進(jìn)傷口愈合并抑制瘢痕形成， 對(duì)于皮膚損傷表現(xiàn)出良好的修復(fù)作用[2-3]。 然而，獲取這些細(xì)胞來(lái)源的外泌體往往需要培養(yǎng)大量的細(xì)胞，技術(shù)敏感性高、耗時(shí)長(zhǎng)且成本高。 尋找便捷高效的外泌體具有極其重要的意義。

外泌體也存在于多種體液當(dāng)中，正常人每日唾液分泌量約為1.0~1.5 L，獲取容易。 健康人的唾液能加快皮膚損傷的愈合過(guò)程[4-5]。 我們推測(cè)，唾液中的外泌體在此過(guò)程中能夠發(fā)揮類似的作用。 有研究表明,唾液中富含大量外泌體，相關(guān)研究主要集中在唾液外泌體在口腔疾病的診斷、標(biāo)志的應(yīng)用中[6]，在促進(jìn)損傷修復(fù)、 抑制瘢痕組織形成方面應(yīng)用較少。另有研究表明，人唾液來(lái)源的細(xì)胞外囊泡表面富含凝血組織因子（coagulant tissue factor，CTF），可傳遞至活化的血小板促進(jìn)凝血，進(jìn)而降低感染風(fēng)險(xiǎn)促進(jìn)愈合。 但是唾液外泌體（S-Exos）對(duì)于皮膚損傷修復(fù)的確切效果有待研究[7]。 本研究通過(guò)切除大鼠背部全層皮膚建立大鼠全層皮膚缺損模型，將唾液和唾液外泌體分別與無(wú)菌水凝膠混合， 制備成注射液，通過(guò)局部皮下注射的方法治療大鼠背部皮膚全層缺損，探討人S-Exos 對(duì)大鼠皮膚全層損傷創(chuàng)面愈合的影響，為臨床皮膚創(chuàng)面修復(fù)提供新的治療策略。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠18 只，6~8 周齡，體質(zhì)量200~260 g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境條件和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均通過(guò)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：201904024）。

1.1.2 主要試劑 多肽水凝膠（Corning 公司，美國(guó)）；CD9、CD63 抗體 （System Bioscience 公司， 美國(guó)）；RIPA 裂解液、 磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）、Masson 染色試劑盒 （Solarbio 公司，美國(guó)）。CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；小鼠/兔鏈霉卵白素-生物素法檢測(cè)試劑盒、DAB 顯色試劑盒、 胃蛋白酶消化液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）。

1.2 唾液收集，S-Exos 的提取、鑒定

1.2.1 唾液收集 根據(jù)知情同意原則， 采集20 例健康成年志愿者（18~35 歲）的唾液，本研究已通過(guò)廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn) （批準(zhǔn)號(hào)：20210065）。 在樣本采集前1 h，志愿者用清水漱口，并避免進(jìn)食、飲水。 用無(wú)菌離心管收集志愿者的非刺激性全唾液（每人5~30 mL），0.5 h 內(nèi)收集完畢。將所有唾液混合，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 S-Fxos 的提取 采用超高速離心法分離SExos， 首先將收集到的唾液用PBS （1∶5） 稀釋，以3000×g、4 ℃下離心30 min；10 000×g、4 ℃下離心40 min；收集上清液，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾；隨后以120 000×g、4 ℃下超速離心90 min 以沉淀外泌體。用PBS 洗滌S-Exos 后，以120 000×g、4 ℃下最后離心90 min 得到S-Exos，PBS 重懸，-80 ℃保存。

1.2.3 透射電鏡觀察S-Fxos 的形態(tài) 吸取樣品10 μL滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液，吸取醋酸雙氧鈾10 μL 滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min， 濾紙吸去浮液，常溫干燥數(shù)min，觀察外泌體的形態(tài)。

1.2.4 Western blotting 檢測(cè)S-Fxos 相關(guān)蛋白 提取唾液蛋白及外泌體蛋白，100 ℃下煮沸變性5 min。等量上樣至十二烷基硫酸鈉聚丙酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）凝膠，120 V 電壓條件下電泳80 min，200 mA 電流條件下轉(zhuǎn)膜90 min， 用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（CD9 1∶1 000；CD63 1∶1 000）4 ℃下孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記二抗（1∶20 000），室溫孵育1 h，滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑后用Bio-blot 曝光儀檢測(cè)灰度值的表達(dá)。

1.3 大鼠全層皮膚缺損模型的建立及分組處理

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的描述建立大鼠皮膚全層缺損模型，18 只大鼠用3%戊巴比妥鈉以30 mg/kg 的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉[8]。 待大鼠麻醉后，剃除背部毛發(fā)，消毒鋪巾，以脊柱為中線，采用皮膚活檢打孔器在大鼠背部制作2 個(gè)皮膚全層損傷創(chuàng)面，即2 個(gè)直徑為10 mm 的圓形對(duì)稱損傷， 止血， 用3M Tegaderm 輔料覆蓋1 d，隨后保持創(chuàng)面開放。損傷模型建立的當(dāng)天記為第0 天。 將18 只大鼠隨機(jī)分為3 組，分別為對(duì)照組、唾液處理組、外泌體處理組，每組6 只大鼠共12 個(gè)創(chuàng)面。 各組注射液的制備如下。 對(duì)照組：PBS 與1%的水凝膠以1∶1 的比例混合； 唾液處理組： 唾液與1%的水凝膠以1∶1 的比例混合；外泌體處理組：唾液外泌體（400 μg/mL）與1%的水凝膠以1∶1 的比例混合。 根據(jù)分組，于術(shù)后48 h 每個(gè)創(chuàng)緣皮下注射100 μL 注射液（分為4 個(gè)點(diǎn)注射，每點(diǎn)25 μL）。

1.4 創(chuàng)面愈合情況觀察

觀察記錄傷口愈合情況，在第0、4、8、12、14 天時(shí)拍照、記錄大鼠皮膚損傷修復(fù)情況，用ImageJ Fiji軟件（NIH 公司，美國(guó)）測(cè)量傷口面積，計(jì)算傷口愈合率。 傷口愈合率（%）=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.5 組織學(xué)觀察

分別于第14 天和第35 天隨機(jī)處死各組小鼠，每組3 只。 采集損傷部位全層皮膚組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，收集所有樣本，在樣本的最大直徑處， 連續(xù)切取3~5 張4 μm 的切片，HE 染色觀察大鼠皮膚損傷處的組織學(xué)表現(xiàn)，每組選取3 個(gè)樣本， 每個(gè)樣本切片隨機(jī)選取3 個(gè)同樣大小的視野（×400），統(tǒng)計(jì)視野中細(xì)胞核的數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 采用GraphPad Prism 6 軟件繪圖。 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S-Exos 提取物的檢測(cè)及鑒定

用透射電鏡觀察S-Exos（圖1A），來(lái)自唾液的外泌體有雙層膜結(jié)構(gòu), 呈“杯托”樣，直徑約為70 nm；Western blotting 結(jié)果（圖1B）顯示，唾液中提取到的外泌體生物標(biāo)志物CD9 和CD63 表達(dá)陽(yáng)性。

圖1 唾液外泌體的鑒定及表征Figure 1 Identification and characterization of S-Exos

2.2 各組大鼠皮膚全層缺損愈合情況

第0 天， 成功建立了大鼠皮膚全層缺損模型，全層皮膚被切除，皮下組織完全暴露，皮膚活檢打孔器形成的圓形創(chuàng)口邊緣整齊， 面積大致相同（78.5 mm2）。 圖2A 分別顯示了對(duì)照組、唾液處理組和外泌體處理組在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的皮膚創(chuàng)面圖像。 在不同時(shí)間點(diǎn)，傷口處均未發(fā)現(xiàn)炎癥或感染跡象。 術(shù)后傷口周圍表皮向皮膚缺損處生長(zhǎng)延伸，各組創(chuàng)面均有不同程度的收縮， 從術(shù)后第4 天開始，唾液外泌體處理組呈現(xiàn)出加速大鼠皮膚損傷愈合趨勢(shì)。 術(shù)后第8 天，外泌體處理組大鼠背部創(chuàng)面愈合率高達(dá)（92.44±3.93）%， 顯著高于對(duì)照組[（79.05±6.35）%]和唾液處理組[（73.93±8.35）%]（P<0.01，表1）。術(shù)后第12 天，各組創(chuàng)緣新生上皮生長(zhǎng)明顯，創(chuàng)緣新皮較薄，呈透明狀，無(wú)毛發(fā)生長(zhǎng)，外泌體處理組損傷基本愈合。 術(shù)后第14 天， 傷口處血痂均已自行脫落，各組創(chuàng)面均基本愈合，部分皮膚創(chuàng)面仍有點(diǎn)狀上皮未覆蓋的區(qū)域，其面積與初始面積相比，平均縮小98%以上（表1）；可見(jiàn)瘢痕組織形成，顏色較正常皮膚淺。 術(shù)后第35 天，各組損傷部位瘢痕組織肉眼形態(tài)無(wú)明顯差異。

圖2 各組大鼠皮膚缺損愈合情況及愈合率Figure 2 Skin defects repair conditions and healing rates

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較(n=6，x±s)Table 1 Skin wound healing rate of rats at different time points in different groups （n=6，x±s）

2.3 各組大鼠損傷部位組織學(xué)觀察

術(shù)后第14 天， 觀察各組大鼠皮膚缺損處組織（圖3A）， 各組創(chuàng)面呈現(xiàn)出不同程度的肉芽組織增生狀態(tài)，成纖維細(xì)胞和膠原纖維大量增殖，肉芽組織表面上皮組織增生，較正常皮膚組織增厚，結(jié)構(gòu)與正常皮膚相似。 各組均有毛細(xì)血管新生，并且觀察到外泌體處理組損傷部位細(xì)胞密度較高，通過(guò)細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)，外泌體處理組皮膚損傷處的細(xì)胞（主要為成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞）數(shù)目（324±70）明顯多于對(duì)照組（123±12）和唾液處理組（227±81），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 術(shù)后第35 天，各組損傷處組織均可見(jiàn)大量細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積，各組成纖維細(xì)胞密度均較14 d 時(shí)減少，炎癥細(xì)胞少見(jiàn)。 外泌體處理組的缺損處皮膚表皮組織增生程度減輕，與正常皮膚表皮厚度相似；細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維呈現(xiàn)出有序的平行排列，皮膚組織中可見(jiàn)個(gè)別毛囊生成（圖3B）。 相反，對(duì)照組和唾液處理組仍有較厚的表皮增生，皮下組織中存在大量膠原纖維堆積，且結(jié)構(gòu)更為松散，分布雜亂；未見(jiàn)皮膚附屬器生成。

圖3 各組大鼠皮膚創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)和細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)Figure 3 Histological features of cutaneous wound healing and cell density measurement

3 討論

本研究中采用了多肽水凝膠作為外泌體及其他注射物的支架。 水凝膠是具有3D 結(jié)構(gòu)的黏性聚合物，具有與天然組織相似的物理性質(zhì)[9]。 無(wú)菌多肽水凝膠具有良好的生物相容性，呈納米級(jí)纖維結(jié)構(gòu)，平均孔徑為50~200 nm，為組織的再生提供了3D 微環(huán)境。 本研究將唾液外泌體與多肽水凝膠混合，提供了組織再生的支架， 水凝膠形成了膨脹3D 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能使分子和細(xì)胞自由擴(kuò)散，并延長(zhǎng)了外泌體在局部的作用時(shí)間[10]。

皮膚損傷的修復(fù)是一個(gè)連續(xù)和重疊的過(guò)程，一般需要經(jīng)歷炎癥、增殖和重塑3 個(gè)階段[11-12]，其中涉及多種細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的參與和互相協(xié)調(diào)。 當(dāng)機(jī)體皮膚受到損傷后， 通過(guò)清創(chuàng)協(xié)調(diào)各種趨化因子，炎癥細(xì)胞募集，清除異物和壞死組織。 同時(shí)，炎癥細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等的分裂和增殖， 有助于缺損皮膚的修復(fù)。傷口一旦閉合， 重塑階段開始， 此時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）改變，膠原網(wǎng)絡(luò)重塑，不規(guī)則的膠原纖維趨向于規(guī)則。 既往研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可以通過(guò)多種方式在組織修復(fù)中發(fā)揮作用，其中包括調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、傳遞血管生成信號(hào)、調(diào)節(jié)膠原重塑等方式[13]。

據(jù)報(bào)道，S-Exos 可提升成纖維細(xì)胞的增殖和遷移能力，這有助于在傷口區(qū)域產(chǎn)生收縮力，這一過(guò)程主要發(fā)生在傷口愈合初始階段[14]。本研究中，經(jīng)SExos 處理后的皮膚傷口愈合更快，表現(xiàn)為損傷后傷口早期收縮迅速， 在術(shù)后第8 天顯示出明顯差異；術(shù)后第14 天觀察損傷部位組織形態(tài)發(fā)現(xiàn)， 外泌體處理組細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組和唾液處理組（P＜0.05）， 表明S-Exos 可以刺激損傷部位成纖維細(xì)胞的增殖，由此產(chǎn)生的收縮力可能是外泌體處理組改善傷口愈合的原因之一。 外泌體處理組在術(shù)后14 d時(shí)，炎癥細(xì)胞數(shù)目增多，同時(shí)新生血管豐富，傷口中的血管生成水平通常與炎癥反應(yīng)相關(guān)，炎癥細(xì)胞產(chǎn)生大量促血管生成介質(zhì)[15]，毛細(xì)血管網(wǎng)的生成有助于肉芽組織的形成，這些組織學(xué)表現(xiàn)提示了S-Exos能通過(guò)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、調(diào)節(jié)缺損部位的炎癥反應(yīng)等促進(jìn)傷口愈合。

正常皮膚由2 個(gè)組織層組成：角質(zhì)化的表皮層和富含膠原纖維的真皮層。 毛發(fā)和腺體等附屬物源自表皮并與之相連，深入真皮層[16]，表皮作為生物體的最外層，通過(guò)上皮細(xì)胞的遷移和增殖快速閉合傷口部位。 本研究中，各組大鼠皮膚受到損傷后，均可觀察到表皮組織的快速增殖變厚，這對(duì)于恢復(fù)生物體的屏障功能至關(guān)重要。 當(dāng)機(jī)體受到損傷后，理想的組織再生不是單純的缺損部位修補(bǔ)，而是組織結(jié)構(gòu)三維形態(tài)的恢復(fù)。 我們期望皮膚缺損能夠最大程度恢復(fù)到正常皮膚的組織形態(tài)，包括皮膚附屬器的再生。 皮膚附屬器是皮膚生理功能的組成部分，以往認(rèn)為， 毛囊形成通常只發(fā)生在胚胎發(fā)育過(guò)程中[17]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)皮膚組織的再生潛力被激活后，傷口的愈合過(guò)程與胎兒相似，可實(shí)現(xiàn)毛囊的新生[18-19]。 多種來(lái)源的外泌體確實(shí)可以促進(jìn)毛囊的新生和毛發(fā)的生長(zhǎng)， 包括角質(zhì)形成細(xì)胞來(lái)源的外泌體、神經(jīng)祖細(xì)胞衍生的外泌體、真皮乳頭細(xì)胞分泌的外泌體、脂肪干細(xì)胞來(lái)源的外泌體等[20-23]，通過(guò)促進(jìn)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活[20-21]，促進(jìn)了毛囊細(xì)胞生長(zhǎng)周期的調(diào)控， 提示外泌體可能包含有促進(jìn)毛囊新生的成分， 其中外泌體中的microRNA（miRNA）可能參與調(diào)控毛囊新生過(guò)程：神經(jīng)祖細(xì)胞衍生的外泌體傳遞的miR-100 抑制多個(gè)β-catenin負(fù)調(diào)節(jié)因子并增加β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而誘導(dǎo)毛囊再生[20]；真皮乳頭細(xì)胞分泌的外泌體中，miR-218-5p 上調(diào)，靶向SFRP2，進(jìn)而上調(diào)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)毛囊發(fā)育[21]。本研究中，我們?cè)谛g(shù)后35 d時(shí)觀察到外泌體處理組有毛囊皮膚附屬器生成，表明人S-Exos 也具有促進(jìn)毛囊再生的作用； 同時(shí)，外泌體處理組表皮增生情況恢復(fù)，說(shuō)明外泌體處理后的損傷部位能夠恢復(fù)到正常皮膚組織結(jié)構(gòu)。

本研究利用人S-Exos 促進(jìn)缺損皮膚的愈合和表皮附屬物再生，達(dá)到了較好的損傷修復(fù)效果。本研究可為臨床皮膚創(chuàng)面修復(fù)提供新的治療策略。