唐 超 易曉華 沙元帥 曹靖茹 郭立忠

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109）

0 引言

醋酸纖維薄膜電泳是以醋酸纖維薄膜為分離介質(zhì)的一種水平電泳，它具有分辨率較高、微量、快速等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛在應(yīng)用血清蛋白、脂蛋白、酶的分離和免疫電泳等方面，是醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等臨床檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)，也是高校動物類相關(guān)專業(yè)生物化學(xué)經(jīng)常開設(shè)的實(shí)驗(yàn)課之一。

醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)常規(guī)緩沖系統(tǒng)為巴比妥-巴比妥鈉（0.09mol/L，pH8.6），但是巴比妥類試劑常被用作神經(jīng)系統(tǒng)鎮(zhèn)靜劑，有一定毒性，對實(shí)驗(yàn)學(xué)生和生態(tài)環(huán)境造成潛在安全隱患。而且巴比妥類試劑屬于國家管制藥品，價格較高，不適合大批量采購。因此有必要用另一種常見緩沖系統(tǒng)替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，同時優(yōu)化其實(shí)驗(yàn)條件，達(dá)到和巴比妥-巴比妥鈉緩沖系統(tǒng)一樣的實(shí)驗(yàn)效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

此次試驗(yàn)選取的初生牛血清。

1.2 儀器和器材

電泳儀（北京市六一儀器廠DYY-10C）；電泳槽（北京六一儀器廠DYC38B）；pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司FE28）；醋酸纖維薄膜（路橋四甲生化塑料廠2cm×8cm）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計

緩沖系統(tǒng)優(yōu)化：選用以下5種常見緩沖系統(tǒng)，離子強(qiáng)度、pH值與巴比妥緩沖系統(tǒng)相同（0.09mol/L，pH8.6）。NaHPO-KHPO、Tris-HCl、硼酸-四硼酸鈉、四硼酸鈉-HCl、甘氨酸-NaOH。

電極緩沖液離子強(qiáng)度優(yōu)化：從上述緩沖液中選定一種有可能替代巴比妥緩沖系統(tǒng)的緩沖液，并優(yōu)化其離子強(qiáng)度，第一次粗分級試驗(yàn)：0.10mol/L、0.13mol/L、0.15mol/L、0.18mol/L、0.21mol/L、0.25mol/L、0.30mol/L、0.35mol/L、0.40mol/L；第二次細(xì)分級試驗(yàn)：0.20mol/L、0.22mol/L、0.24mol/L、0.26mol/L、0.28mol/L。

電極緩沖液pH值優(yōu)化：用pH計調(diào)節(jié)緩沖液pH值。第一次粗分級試驗(yàn)：pH8.0、pH8.2、pH8.4、pH8.7、pH9.0；第二次細(xì)分級試驗(yàn)：pH8.70、pH8.79、pH8.85、pH8.92、pH9.00、pH9.05、pH9.08。

電極緩沖液重復(fù)應(yīng)用次數(shù)優(yōu)化：將電泳后的電極緩沖液倒在燒杯中，混勻后作為下一次電泳的電極緩沖液。重復(fù)應(yīng)用次數(shù)設(shè)定為：1次、2次、3次、4次、5次、6次。

1.4 試驗(yàn)方法

以上各處理重復(fù)6次，除此以外應(yīng)用以下電泳條件和方法。將醋酸纖維薄膜預(yù)浸于電極緩沖液中20min；用鑷子取出，放在濾紙上吸干表面液體；用蓋玻片一端蘸取少量牛血清，在距離醋酸纖維薄膜一端1.5cm處點(diǎn)樣；待樣品滲入薄膜后置于電泳槽上電泳；穩(wěn)壓120V，電泳45min；電泳結(jié)束后用0.5%氨基黑10B染色液染色5min；用脫色液脫色兩次，每次10min。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖系統(tǒng)優(yōu)化

牛血清蛋白在巴比妥-巴比妥鈉緩沖系統(tǒng)下能夠明顯區(qū)分出五條帶，見圖1（上正下負(fù)，以下同），分別是白蛋白、α1蛋白、α2蛋白、β蛋白和γ蛋白。雖然各種緩沖溶液具有相同的離子強(qiáng)度和pH值，但是由于帶電粒子本身的特性，在相同電場作用下泳動速率等情況不同，因此NaHPO-KHPO緩沖系統(tǒng)、Tris-HCl緩沖系統(tǒng)、甘氨酸-NaOH緩沖系統(tǒng)無法形成有效區(qū)帶。血清蛋白在硼酸-四硼酸鈉和四硼酸鈉-HCl緩沖系統(tǒng)中能夠進(jìn)行有效區(qū)分，但只有4條區(qū)帶。考慮到電泳過程中會產(chǎn)熱，硼酸更穩(wěn)定。因此，用硼酸-四硼酸鈉替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖系統(tǒng)是可行的。

圖1 緩沖系統(tǒng)優(yōu)化結(jié)果

2.2 電極緩沖液離子強(qiáng)度優(yōu)化

電極緩沖液中離子強(qiáng)度直接關(guān)系到蛋白質(zhì)的遷移速率，通常離子強(qiáng)度越低，蛋白質(zhì)遷移得越快。但樣品易擴(kuò)散，分辨率下降，同時緩沖能力弱，溶液pH穩(wěn)定性差。因此，對緩沖液離子強(qiáng)度的選擇要兼顧這兩方面因素。

由圖2可知，在離子強(qiáng)度較低的情況下，血清蛋白質(zhì)區(qū)帶較為擴(kuò)散，含量較低的α1蛋白無法觀察到，分辨率低。隨著離子強(qiáng)度增大，蛋白質(zhì)越易形成較為凝聚的區(qū)帶。圖3中b~e已經(jīng)可以獲得五條較明顯的蛋白區(qū)帶。但由于學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作時較難把握點(diǎn)樣量，點(diǎn)樣過多，電泳區(qū)帶過于凝聚反而會分辨不清楚。因此離子強(qiáng)度維持在0.22~0.26mol/L之間，既能獲得較好的電泳分辨率，又能夠去除點(diǎn)樣過多帶來的弊端。

圖2 電極緩沖液不同離子強(qiáng)度電泳圖譜

圖3 電極緩沖液不同離子強(qiáng)度電泳圖譜

2.3 電極緩沖液pH值優(yōu)化

蛋白質(zhì)在電泳的過程中，電極緩沖液的pH值會影響其帶電性和帶電量，也影響最終的電泳結(jié)果。從圖4可以看出，電極緩沖液越偏堿性，蛋白區(qū)帶越凝聚，當(dāng)pH值在8.7~9.0之間時能夠清晰地分辨出血清蛋白質(zhì)的五條區(qū)帶。當(dāng)pH>9.0以后，蛋白區(qū)帶過于凝集，學(xué)生操作如果點(diǎn)樣過量，反而會降低分辨率。為了便于觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，pH8.7~8.8較為適合。

圖4 電極緩沖液不同pH值電泳圖譜（粗分級和細(xì)分級）

2.4 電極緩沖液重復(fù)應(yīng)用次數(shù)優(yōu)化

由圖5可知，電極緩沖液重復(fù)使用6次后醋酸纖維薄膜譜帶仍然清晰，染色脫色后分辨率較高，并不影響電泳實(shí)驗(yàn)效果。重復(fù)利用電極緩沖液不但可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，還可以減少環(huán)境污染。

圖5 電極緩沖液重復(fù)利用次數(shù)電泳結(jié)果

3 討論

醋酸纖維薄膜電泳具有操作簡便、分辨率較高、應(yīng)用較廣等特點(diǎn)，尤其適合在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用。操作過程中需要準(zhǔn)備的主要試劑就是電極緩沖液，其組成試劑是否容易購置、價格合理，是醋酸纖維薄膜電泳能否在基層得到廣泛應(yīng)用的前提。硼酸和四硼酸鈉是常見的化學(xué)試劑，價格低廉，無毒無污染，還可以重復(fù)應(yīng)用，是可以替換巴比妥緩沖系統(tǒng)的環(huán)保試劑。也可以將硼酸-四硼酸鈉根據(jù)生產(chǎn)和科研需要制作成試劑盒，進(jìn)行快速溶解，省時省力。

影響醋酸纖維薄膜電泳結(jié)果的因素很多，除了緩沖系統(tǒng)組成、離子強(qiáng)度、pH值、電壓、電流以外，醋酸纖維薄膜的質(zhì)量也是影響電泳效果的重要因素。本試驗(yàn)在分辨率較高的情況下，不同血清蛋白質(zhì)遷移率比較接近，集中在醋酸纖維薄膜中間部位，這與不同廠家生產(chǎn)的醋酸纖維薄膜孔隙度、均勻度、厚度等都有密切關(guān)系。以后可以對不同廠家的醋酸纖維薄膜進(jìn)行對照試驗(yàn)，在保證分辨率的前提下，增加各種蛋白質(zhì)遷移率的差異，提高觀察效果。

綜上所述，在醋酸纖維薄膜電泳中，硼酸-四硼酸鈉可以替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖系統(tǒng)，離子強(qiáng)度在0.22~0.26mol/L之間，pH值在8.7~8.8之間較為適合，重復(fù)應(yīng)用6次也不會影響電泳效果。