劉鵬冀，王文強(qiáng)，2，苑彩霞，2*

（1. 延安大學(xué)生命科學(xué)院；2. 陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安 716000）

隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的昆蟲(chóng)分類研究者將分子生物技術(shù)應(yīng)用于昆蟲(chóng)多樣性、系統(tǒng)發(fā)育、近緣種識(shí)別、基因遺傳、進(jìn)化關(guān)系等領(lǐng)域［1-2］。研究昆蟲(chóng)DNA 信息的基礎(chǔ)便是昆蟲(chóng)DNA的提取［3］。常規(guī)的DNA 提取方法一般使用新鮮的昆蟲(chóng)樣品作為材料，但研究所需要的昆蟲(chóng)樣本大多來(lái)自于野外采集，采集到的標(biāo)本在攜帶和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中長(zhǎng)時(shí)間放置易變質(zhì)，DNA 易降解。因此進(jìn)行分子研究的昆蟲(chóng)標(biāo)本在野外多采用無(wú)水乙醇進(jìn)行保存，這種保存方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便且無(wú)毒，能在一定程度上減緩DNA 的降解速度，但是長(zhǎng)時(shí)間的酒精浸泡也會(huì)引起細(xì)胞中的蛋白質(zhì)與DNA 間產(chǎn)生嚴(yán)重的交聯(lián)，導(dǎo)致提取到的DNA 質(zhì)量變差，難以擴(kuò)增目標(biāo)序列，不能達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，有時(shí)可通過(guò)增加樣品數(shù)量或進(jìn)行多次DNA 提取來(lái)選出合格的DNA 樣品［4］。而對(duì)于數(shù)量較少的珍貴酒精浸制標(biāo)本則無(wú)法用增加樣品數(shù)量的方法來(lái)提高DNA 產(chǎn)量，從而影響整體實(shí)驗(yàn)的效果和進(jìn)度。通過(guò)預(yù)處理來(lái)提高DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量就成了酒精浸制昆蟲(chóng)標(biāo)本的關(guān)鍵步驟。

高質(zhì)量的DNA 對(duì)于解決物種或基因之間的關(guān)系、物種的起源和傳播等生物學(xué)問(wèn)題至關(guān)重要，若是通過(guò)預(yù)處理方式提高長(zhǎng)期保存的酒精浸制標(biāo)本DNA 提取的濃度和質(zhì)量，則能夠大大提高可用于分子研究的標(biāo)本范圍，這有助于進(jìn)行更加準(zhǔn)確的系統(tǒng)發(fā)育判斷，同時(shí)也有助于進(jìn)行更加廣泛的分子問(wèn)題研究。近年來(lái)，一些研究者在干制昆蟲(chóng)標(biāo)本DNA 提取前進(jìn)行預(yù)處理以達(dá)到提高DNA 質(zhì)量和產(chǎn)量的目的［5-11］。目前干制昆蟲(chóng)標(biāo)本最常用的樣品預(yù)處理物質(zhì)有0.9%NaCl溶液、Tris-EDTA 鹽水緩沖液（STE）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）和無(wú)菌水，0.9%NaCl 溶液、STE 鹽水緩沖液、PBS 磷酸緩沖鹽溶液對(duì)干制昆蟲(chóng)標(biāo)本的基因組DNA 的得率均有一定程度的提高，無(wú)菌水處理則會(huì)降低DNA的得率［1，4，12］。HUANG等［2］通過(guò)對(duì)瓢蟲(chóng)干制標(biāo)本預(yù)處理的研究發(fā)現(xiàn)0.9%NaCl溶液和STE 緩沖液的預(yù)處理效果優(yōu)于PBS 緩沖液。對(duì)于昆蟲(chóng)酒精浸制標(biāo)本而言，目前尚不清楚這4 種預(yù)處理方式是否具有同樣的提升效果。

朽木甲亞科Alleculinae 昆蟲(chóng)隸屬鞘翅目Coleoptera，擬步甲科Tenebrionidae，是重要的傳粉昆蟲(chóng)，但也侵害植物，屬于進(jìn)出口竹材的檢疫對(duì)象［13］。本研究以酒精浸泡的朽木甲標(biāo)本作為研究對(duì)象，使用0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液、PBS 緩沖液和無(wú)菌水4 種物質(zhì)分別對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，借鑒其他學(xué)者［3，14-23］對(duì)昆蟲(chóng)標(biāo)本DNA 提取的研究經(jīng)驗(yàn)，提取其DNA 并對(duì)線粒體COI 基因片段及28S-D2 核基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并對(duì)4 種預(yù)處理方式提取的DNA 濃度及凝膠電泳條帶質(zhì)量進(jìn)行比較分析，篩選出對(duì)朽木甲酒精浸制標(biāo)本DNA 提取優(yōu)化效果最佳的處理方式。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

試驗(yàn)所用昆蟲(chóng)標(biāo)本為阿爾泰櫛甲指名亞種Cteniopinus（s. str.）altaicus altaicus（Gebler，1829）酒精浸制標(biāo)本采集于陜西省子午嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，均用75%乙醇保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后用無(wú)水乙醇-20 ℃保存，標(biāo)本信息見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)本信息

1.2 研究方法

1.2.1 預(yù)處理方式

將昆蟲(chóng)標(biāo)本去掉鞘翅和腹部，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗掉昆蟲(chóng)體表酒精，放在烘箱中50 ℃烘10 min，以去除標(biāo)本體內(nèi)的酒精，隨后將標(biāo)本放入離心管，每管內(nèi)放1個(gè)標(biāo)本。將蟲(chóng)體分為5組，每組進(jìn)行3次重復(fù)，分別進(jìn)行以下處理：①滅菌0.9%NaCl 溶液浸泡24 h；②滅菌STE 緩沖液浸泡24 h；③滅菌PBS 溶液浸泡24 h；④無(wú)菌水浸泡24 h；⑤CK 對(duì)照處理，繼續(xù)用無(wú)水乙醇浸泡，浸泡處理期間室溫保持在20 ℃，每個(gè)樣本加1 mL浸泡液。

1.2.2 DNA提取

參照昆蟲(chóng)DNA 提取試劑盒（Omega Bio-tek，USA）提取并進(jìn)行以下優(yōu)化：

1）預(yù)處理的標(biāo)本從浸泡液中取出后用無(wú)菌水沖洗掉表面浸泡液，烘干體表浸泡液后放入1.5 mL無(wú)酶離心管中，避免殘留預(yù)處理液對(duì)提取步驟產(chǎn)生影響；

2）直接在1.5 mL 微量無(wú)酶離心管中加入液氮，使用一次性微管杵粉碎樣品至粉末狀，減少在研缽中研磨再倒入離心管中造成的樣品損失，從而降低操作誤差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；

3）延長(zhǎng)空柱子離心時(shí)間至10 min，避免乙醇?xì)埩魧?duì)下游實(shí)驗(yàn)的影響；

4）洗脫前將Elution Buffer 預(yù)熱至60 ℃，再加入柱子中，并在孵育5 min 后進(jìn)行2 次洗脫，避免部分樣品產(chǎn)物濃度偏低。

使用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)樣品DNA濃度及OD 值，用來(lái)體現(xiàn)DNA 質(zhì)量。將提取后DNA保存于-20 ℃冰箱中用于PCR擴(kuò)增。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

采用AG 2×Pro Master Mix（湖南艾科瑞生物工程有限公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL：模板DNA 1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，無(wú)菌水7.4 μL。PCR 反應(yīng)溫度體系：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性30 s；48 ℃退火30 s，循環(huán)35 次；70 ℃延伸50 s；72 ℃最終延伸50 s。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列信息[24-25]

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean SD）表示，進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05 與P<0.01 分別表示差異顯著與極顯著。采用GraphPad Prism 8繪制DNA 濃度和凝膠電泳灰度值圖。采用Image J 對(duì)凝膠電泳條帶灰度值進(jìn)行測(cè)量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同預(yù)處理DNA濃度及純度分析

為了研究不同預(yù)處理方式對(duì)DNA 提取質(zhì)量的影響，通過(guò)微量紫外分光光度計(jì)對(duì)不同預(yù)處理組DNA提取樣本的OD值和DNA濃度進(jìn)行檢測(cè)（圖1）。不同預(yù)處理方式的OD260/280值在1.729~1.849 之間，純度均在合理范圍內(nèi)，且沒(méi)有顯著差異。從圖1 中可以看出，不同預(yù)處理方式對(duì)DNA 濃度所造成的影響差異較大，4 種預(yù)處理方式中除了無(wú)菌水，0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液、PBS 緩沖液其他3 種預(yù)處理方式均對(duì)DNA 濃度有顯著提升（P<0.05），其中PBS預(yù)處理的DNA 提取濃度最高，相較于對(duì)照組和無(wú)菌水處理提高極顯著（P<0.01）。

2.2 基因片段的PCR擴(kuò)增

提取到足夠濃度的DNA 后，還需要基因片段足夠完整以保證PCR 擴(kuò)增能夠順利進(jìn)行，因此進(jìn)一步分別對(duì)線粒體COI 基因片段和核基因28S-D2 基因片段的PCR 擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳拍照和灰度值的分析（圖2和圖3）。

圖1 不同預(yù)處理方式DNA濃度顯著性分析圖

由圖2 可知，相較于無(wú)菌水處理，經(jīng)過(guò)其他3 種預(yù)處理方式的凝膠電泳條帶更加清晰明亮，其中N2和P3 這2 個(gè)條帶最為明亮。對(duì)照組條帶清晰，但是不如0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液、PBS 緩沖液預(yù)處理組明亮，說(shuō)明0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液和PBS緩沖液這3 種預(yù)處理方式有助于保護(hù)DNA 鏈的完整性，有利于PCR 的擴(kuò)增，而無(wú)菌水處理則不利于PCR 擴(kuò)增。由圖3 可見(jiàn)，對(duì)于線粒體COI 基因片段，預(yù)處理方式對(duì)于凝膠電泳條帶灰度值沒(méi)有顯著的提升（P>0.05）。

圖2 2種引物PCR凝膠電泳圖

由圖3 可以得出，對(duì)于核基因28S-D2 基因片段，0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液、PBS 緩沖液這3 種預(yù)處理的灰度值相較于無(wú)菌水處理均提升極顯著（P<0.01），相較于對(duì)照組提升顯著（P<0.05）。圖2中PBS 緩沖液和0.9%NaCl 溶液預(yù)處理?xiàng)l帶更加明亮，P3 條帶最為明亮，說(shuō)明PBS 預(yù)處理對(duì)核基因PCR 擴(kuò)增優(yōu)化效果更好。H3 幾乎沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，其他無(wú)菌水的條帶亮度也很微弱，說(shuō)明無(wú)菌水對(duì)核基因PCR 擴(kuò)增的負(fù)面影響更大，相較于對(duì)照組更易使DNA 片段斷裂。

圖3 2種引物PCR凝膠電泳灰度值顯著性分析圖

3 討論

通過(guò)DNA 提取濃度和凝膠電泳結(jié)果表明：0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液和PBS 緩沖液3 種預(yù)處理方式能夠有效提高提取的DNA 濃度，并有助于基因片段的擴(kuò)增，其中使用PBS 緩沖液進(jìn)行預(yù)處理對(duì)于酒精浸制朽木甲標(biāo)本DNA 的綜合提取優(yōu)化效果最好。HUANG 等［2］在瓢蟲(chóng)干制標(biāo)本的預(yù)處理對(duì)比中發(fā)現(xiàn)0.9% NaCl 溶液、STE 緩沖液的預(yù)處理效果優(yōu)于PBS 緩沖液。標(biāo)本的預(yù)處理需要緩沖液調(diào)節(jié)滲透壓和pH 值，通過(guò)緩慢地滲透作用使細(xì)胞在盡可能不被破壞的情況下恢復(fù)到正常的生理環(huán)境，這有利于提高后續(xù)DNA 提取的質(zhì)量。PBS 緩沖液和STE 緩沖液均能起到這樣的作用，根據(jù)之前有關(guān)DNA 提取的研究和本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果推測(cè)：對(duì)于昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，在干制標(biāo)本中使用STE 緩沖液進(jìn)行預(yù)處理有助于脫水的肌肉組織緩慢的恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)，從而優(yōu)化DNA提取的效果［1-2，4，6，14］。在酒精浸制標(biāo)本中使用PBS 緩沖液進(jìn)行預(yù)處理有助于解決長(zhǎng)時(shí)間的酒精浸泡引起細(xì)胞中的蛋白質(zhì)與DNA 間產(chǎn)生嚴(yán)重交聯(lián)的問(wèn)題，從而優(yōu)化DNA 提取效果。這樣在對(duì)不同保存方式的昆蟲(chóng)DNA 進(jìn)行提取預(yù)處理時(shí)可以選擇更加合適的試劑，有助于對(duì)昆蟲(chóng)基因的進(jìn)一步研究。

本研究得到不同預(yù)處理方式對(duì)昆蟲(chóng)樣品提取到的DNA的OD260/280值差距不大，結(jié)合李枷霖等［1］對(duì)干制昆蟲(chóng)標(biāo)本的預(yù)處理方式研究結(jié)果，推測(cè)其原因可能是：1）DNA 的OD260/280值的大小主要與樣本的種類有關(guān)，不同的處理方式對(duì)其影響較?。?）本實(shí)驗(yàn)所采用的昆蟲(chóng)標(biāo)本保存條件穩(wěn)定，保存時(shí)間不是很長(zhǎng)，DNA 的質(zhì)量相對(duì)較高，從OD 值看不出不同預(yù)處理方式造成的差異。

從圖3 可以看出0.9%NaCl 溶液、STE 緩沖液、PBS 緩沖液3 種預(yù)處理方式對(duì)于核基因的擴(kuò)增提升效果極顯著。而對(duì)于線粒體基因條帶的擴(kuò)增提升效果并不顯著。由此推測(cè)0.9% NaCl 溶液、STE 緩沖液、PBS 緩沖液這3 種預(yù)處理方式對(duì)于昆蟲(chóng)酒精浸制標(biāo)本核基因DNA 片段的擴(kuò)增優(yōu)化效果更佳，其中經(jīng)過(guò)PBS預(yù)處理擴(kuò)增出的條帶更加明亮。

張德華等［4］認(rèn)為使用無(wú)菌水進(jìn)行預(yù)處理在換水過(guò)程中會(huì)使部分細(xì)胞內(nèi)DNA 丟失，因此為避免細(xì)胞DNA 流失，實(shí)驗(yàn)在用無(wú)菌水預(yù)處理的過(guò)程中并未進(jìn)行換水操作。但是相較于對(duì)照組在樣品DNA 的濃度及凝膠電泳的圖像上并沒(méi)有看出對(duì)于樣品DNA提取的優(yōu)化效果。從圖2 可以看出，用無(wú)菌水進(jìn)行預(yù)處理后對(duì)核基因片段的擴(kuò)增效果甚至不如對(duì)照組，起到了負(fù)面的效果，因此無(wú)菌水在預(yù)處理的過(guò)程中不但易使細(xì)胞吸水破裂降低提取到的DNA 濃度，還會(huì)使DNA 片段斷裂，影響基因PCR 的擴(kuò)增效果。在昆蟲(chóng)DNA 提取的過(guò)程中應(yīng)盡量減少昆蟲(chóng)樣本與無(wú)菌水的接觸。

0.9%NaCl溶液、STE緩沖液、PBS緩沖液和無(wú)菌水4 種預(yù)處理方式對(duì)朽木甲酒精浸制標(biāo)本DNA 質(zhì)量濃度及凝膠電泳圖像的結(jié)果表明，使用無(wú)菌水不會(huì)提高DNA 提取的產(chǎn)量，且會(huì)降低PCR 擴(kuò)增的效果，對(duì)DNA 的提取效果起到負(fù)面的作用；使用0.9%NaCl溶液、STE緩沖液、PBS緩沖液對(duì)朽木甲酒精浸制標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理可以提高DNA 提取濃度，對(duì)DNA 基因片段擴(kuò)增效果也有提升，特別是在核基因片段中優(yōu)化效果更好。綜合來(lái)看使用PBS 緩沖液對(duì)朽木甲酒精浸制標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理對(duì)DNA 的提取效果最佳，這有助于優(yōu)化昆蟲(chóng)DNA 提取的方法和思路。為在提取昆蟲(chóng)DNA 的過(guò)程中，面對(duì)不同保存方式、不同基因片段進(jìn)行預(yù)處理提供了更多的參考，減少了在DNA 提取過(guò)程中標(biāo)本數(shù)量的消耗，一定程度上擴(kuò)展了可研究標(biāo)本的范圍，為后續(xù)的分子研究工作奠定基礎(chǔ)。