劉新榮 劉永華 楚蔚琳

青島市市立醫(yī)院(266000)

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中死亡率高，目前治療方法以手術后化療最為常見，而化療藥品中紫杉醇應用較為廣泛[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)可能作為一類新的癌基因或抑癌基因在腫瘤細胞的產生和生長過程中發(fā)揮重要作用[2]。由于miRNA可在翻譯水平上抑制基因表達，參與細胞生長和分化，推測可能與癌細胞是否耐藥存在相關性。為驗證上述猜測，本研究通過基因檢測技術檢測卵巢癌細胞耐藥與敏感的miRNA表達差異，并通過Western Blot方法對預測的靶基因表達進行驗證，為提高卵巢癌的有效治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 標本獲取及檢測

選擇2016年3月-2020年3月在本院治療的卵巢癌患者病變標本。利用mirVanaTMRNA Isolation試劑盒(美國Ambion公司)提取 RNA。總RNA濃度、純度和完整性的驗證利用Agilent 2100 Bio analyzer系統(tǒng)自動分析。耐藥與敏感細胞均使用1640培養(yǎng)基(10%FBS，青霉素100mg/L，鏈霉素100mg/L)，在30nmol/L紫杉醇條件下，使得SKOV3-TR30細胞維持耐藥。在穩(wěn)定的培養(yǎng)條件下獲得對數(shù)生長期細胞進行下一步實驗，培養(yǎng)環(huán)境設置為溫度37.5℃、濕度飽和、5%CO2。

1.2 芯片雜交及數(shù)字化處理

將提取出的RNA通過添加多聚腺苷酸尾(polyA)與熒光標記鏈接，應用miRNA寡核苷酸基因芯片試劑盒(Affymetrix)進行芯片雜交。按照Gene Chip Hybridization Wash and Stain(Affymetrix)試劑盒，全自動洗脫染色工作站(Fluidics Station 450)進行染色。Affymeterix GeneChip Commond Console 1.1軟件讀取圖像文件得到Cel原始數(shù)據(jù)；應用miRNA QC tool 處理得到txt標準化數(shù)據(jù)。與SKOV3相比，當比值>1時認為miRNA高表達，<1時低表達。采用Real-time PCR對芯片進行驗證。

1.3 miRNA目標靶基因分析及其蛋白表達

為提高靶基因預測的準確性，利用4種生物學分析軟件進行綜合分析，篩選3種以上軟件中有共同結果的基因作為靶基因，其中用到的生物學軟件有Target Scan、Pictar、miRanda和miR Base Targets，采用方法為缺省設置綜合分析。采用Realtime PCR進行靶基因表達檢測，Western Blot方法驗證靶基因蛋白表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 病例基本資料

紫杉醇耐藥患者19例，年齡(55.7±6.8)歲，漿液性癌8例、黏液性癌7例、子宮內膜樣癌4例，腫瘤分期I～Ⅱ期10例、Ⅲ～Ⅳ期9例；非紫杉醇耐藥患者21例，年齡(54.8±5.9)歲，漿液性癌9例、黏液性癌8例、子宮內膜樣癌3例，腫瘤分期I～Ⅱ期11例、Ⅲ～Ⅳ期10例。兩組患者年齡、腫瘤類型、分期無差異(P>0.05)。

2.2 miRNA差異表達分析

經芯片雜交和數(shù)字化處理后分析結果可見，卵巢癌細胞紫杉醇耐藥與敏感相比miR-17、miR-92-1、miR-1307等68個miRNAs高表達，miR-34、miR-134、miR-196b等101個基因低表達，其中miR-134基因與卵巢癌耐藥相關性較大(P<0.05)。見表1。

表1 紫杉醇耐藥與敏感卵巢癌細胞中miR-134表達情況比較

探針SKOV3TR30表達 P SKOV3表達 P 比值hasmiR37927.931370.2785161110.73871.94171E080.252hasmiR38213.151120.597778379.827531.94773E080.165hasmiR4093p21.578950.206733219.84611.03E060.098hasmiR4853p9.711260.85127530.263360.03917140.303hasmiR487a15.154960.495777561.732838.46275E070.241hasmiR487b37.231480.0214586154.33791.91373E080.241hasmiR6543p17.035850.398860145.967723.80035E050.372

2.2 紫杉醇耐藥與非耐藥患者標本miR-134表達

紫杉醇耐藥患者標本miR-134表達水平(0.59±0.36)低于非耐藥患者標本(1.28±0.47)(P<0.01)。

2.3 兩種細胞中miR-134表達

將紫杉醇耐藥的SKOV3-TR30細胞系中miR-134含量設定為1并作為對照組，以SKOV3細胞系中miR-134含量與之比較，得出SKOV3細胞中miR-134含量為1.343(P<0.05)。

2.4 miRNA靶基因檢測

采用Target Scan、Pictar、miRanda和miR Base Targets 4個生物信息學分析軟件綜合分析，對miR-134基因進行靶基因預測。選取至少3種軟件的共同結果作為靶基因，最終預測出miR-134的靶基因有c-Myc、MRPY/ABCC1、Cdc42等共128個。

2.5 miR-134靶基因蛋白表達

Western Blot方法檢測，紫杉醇耐藥的SKOV3-TR30細胞中c-Myc靶基因編碼的蛋白較敏感的SKOV3細胞高表達(P<0.05)；Cdc42基因和MRPY基因編碼的蛋白在耐藥與非耐藥細胞中表達無差異(P>0.05)。見圖1、表2。

圖1 SKOV3和SKOV3-TR30細胞c-Myc、BIM、PTEN蛋白的Western Blot結果

表2 各細胞系中靶基因蛋白的相對含量(相對灰度比值)

2.6 miR-134調控靶基因的表達

在紫杉醇耐藥的SKOV3-TR30細胞(miR-134低表達)中過表達miR-134后，c-Myc基因表達下降，其編碼蛋白也隨之下降(P<0.05)，見圖2a、2b；在非耐藥的SKOV3細胞(miR-134高表達)中敲低miR-134表達后，c-Myc基因表達上升，其編碼的蛋白也隨之上升(P<0.05)。見圖2c、2d。

圖2 miR-134調控靶基因表達

3 討論

3.1 miRNA概述

miRNA為非編碼小RNA，通過轉錄后調控蛋白質表達，臨床上可作為腫瘤診斷、治療、預后判斷及器官移植的生物標志物及治療靶標[3]。隨著研究的深入，人們對其功能的認識逐漸突破了腫瘤的局限，越來越多的疾病和組織中miRNA的表達及作用受到了學者們關注。miRNA首先在細胞核中由初級miRNA通過錨蛋白DGCR8或套索脫支酶作用形成前體miRNA，再由RNA酶III家族成員Dicer加工裂解為成熟雙鏈miRNA，其中一條miRNA鏈通過與靶基因mRNA的3’UTR結合，從而降解或阻遏靶基因的翻譯，使靶基因在細胞中差異性表達來發(fā)揮調控作用[4]。目前已知幾百個miRNA調控人類30%以上的蛋白編碼基因，通過降解目的基因表達調控信號傳導，廣泛參與人類機體多種生理病理過程[5]。

3.2 miRNA134與腫瘤關系

隨著基因檢測技術發(fā)展，基因水平的研究在癌癥治療中作用日漸突出。不斷有研究證實miRNA參與影響了腫瘤細胞對化療藥物的敏感和耐藥[6]。miRNA可在翻譯水平上參與調控細胞生長和分化過程[7]。學者們通過兩個發(fā)現(xiàn)找到了miRNA與惡性腫瘤的關系：一是miRNA定位在癌相關基因組區(qū)及基因組不穩(wěn)定區(qū)域；二是miRNA在正常細胞和惡性腫瘤細胞中表達不同，幾乎所有腫瘤存在miRNA表達異常[8]。目前發(fā)現(xiàn)的50%以上miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關的基因組區(qū)，說明miRNAs在腫瘤發(fā)生過程中的重要作用[9]。

3.3 miR-134與卵巢癌細胞的耐藥性

已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-125、miR-182、miR-200等基因簇均可通過調控靶基因蛋白表達，影響卵巢癌細胞的耐藥性[10]。Shuang T等[11]發(fā)現(xiàn)miR-134表達可影響卵巢癌細胞的耐藥性，且通過調控pak2來實現(xiàn)，但其靶基因和具體調控機制未闡明。本研究在特殊培養(yǎng)基上培養(yǎng)并篩選出紫杉醇耐藥(SKOV3-TR30)和敏感(SKOV3)的卵巢癌細胞系，通過miRNA芯片雜交技術篩選出兩種細胞系間差異表達的miRNA基因譜，發(fā)現(xiàn)共有169個miRNA差異性表達，其中有68個miRNA較紫杉醇敏感的卵巢癌細胞表達上調，101個miRNA較之表達下調，其中miR-134表達下調最明顯。通過測定紫杉醇耐藥與非耐藥患者標本miR-134表達水平發(fā)現(xiàn)，耐藥組miR-134表達低于非耐藥組。進一步通過人體組織標本驗證了紫杉醇耐藥卵巢癌細胞miR-134表達降低的結論。

本次研究發(fā)現(xiàn)，miR-134在敏感卵巢癌細胞中表達下調的基因有has-miR-134、has-miR-154、has-miR-299-3p、has-miR-376c、has-miR-379、has-miR-382、has-miR-409-3p、has-miR-485-3p、has-miR-487a、has-miR-487b、has-miR-654-3p，與Zhu H[12]等研究結果相似。綜合分析，我們預測得c-Myc、MRPY/ABCC1、Cdc42等128個基因為潛在靶基因，而其中c-Myc已有研究證實定位于8q24.21，在卵巢癌組織中擴增率可達50%，被認為是確定的癌基因[13]。為了驗證該預測潛在靶基因，本研究利用Western Blot方法檢測c-Myc在兩種細胞系中的蛋白表達，結果發(fā)現(xiàn)與敏感卵巢癌SKOV3細胞相比，耐藥SKOV3-TR30細胞中c-Myc靶基因蛋白高表達。c-Myc基因是myc基因家族的重要成員之一，是一種可調節(jié)多種物質的基因，在細胞生長、分化及惡性轉化過程中發(fā)揮作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)c-Myc基因在成骨肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤中均出現(xiàn)擴增現(xiàn)象，且過量表達與腫瘤的早期復發(fā)聯(lián)系密切[14]。在紫杉醇耐藥的SKOV3-TR30細胞(miR-134低表達)中過表達miR-134后，c-Myc基因表達下降，其編碼蛋白也隨之下降；在非耐藥的SKOV3細胞(miR-134高表達)中敲低miR-134表達后，c-Myc基因表達上升，其編碼的蛋白也隨之上升。與湯繼英雄[15]等研究結果相符。說明miR-134影響卵巢癌細胞耐藥機制可能是通過調節(jié)靶基因c-Myc來實現(xiàn)的。

綜上所述，本文得出結論：miR-134在紫杉醇耐藥卵巢癌細胞中較敏感癌細胞中低表達且影響耐藥，機制可能是通過調節(jié)c-Myc蛋白潛在靶基因影響c-Myc蛋白的表達而產生耐藥性。本課題組將繼續(xù)以miR-134對c-Myc表達的調控為切入點，在基因層面探究卵巢癌發(fā)生發(fā)展及細胞耐藥機制，為相關基因靶向治療奠定理論基礎。