木則帕爾·太來提 阿尼克孜·阿不都艾尼 賽米熱·艾斯拉

新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院(844000)

慢性盆腔炎(CPID)多發(fā)生在女性內(nèi)生殖器及其周圍結(jié)締組織、盆腔腹膜中，也可能為沙眼衣原體感染后導(dǎo)致輸卵管炎。已逐漸成為女性月經(jīng)紊亂、腰腹疼痛甚至不孕不育的主要病因[1-2]。目前常規(guī)采用阿奇霉素、孢曲松、頭孢西丁等抗生素治療，具有良好的臨床療效，但產(chǎn)生的藥物副作用和耐藥性等問題逐漸引起重視。當(dāng)歸芍藥散是一種中醫(yī)理血方劑，主利妊娠或經(jīng)期血?dú)?，調(diào)養(yǎng)肝脾，祛濕消腫，也可治腹中拘急，糾正胎位[3]。為探究中藥治療機(jī)理，本研究建立大鼠CPID模型，通過分析免疫狀態(tài)及NF-κB信號通路變化探究當(dāng)歸芍藥散對CPID的臨床治療機(jī)理。

1 資料與方法

1.1 動物及藥品試劑

選取實(shí)驗(yàn)動物10周齡大鼠，大鼠體質(zhì)量(200±20)g。本研究獲得動物管理委員會批準(zhǔn)同意。選取當(dāng)歸芍藥散(農(nóng)本方有限公司)，藥方由當(dāng)歸、芍藥、茯苓、澤瀉、川芎、白術(shù)組成。阿奇霉素(輝瑞制藥有限公司)[4]；金黃色葡萄球菌(上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)、大腸桿菌(上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)、乙型溶血性鏈球菌(上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)按照1∶1∶2比例溶入牛肉汁瓊脂湯中配成混合菌液，菌液濃度為3×109個/ml；實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞因子檢測試劑盒、PCR試劑盒(美國ABCAM公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1造模取40只大鼠，隨機(jī)抽取10只設(shè)置對照組，不做處理；另外30只建立CPID模型。所有大鼠均皮下注射10mg黃體酮并喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前1d禁食。需建立CPID模型的30只大鼠先用20%氨基甲酸乙酯行腹腔麻醉，在下腹中部做一1cm切口，暴露大鼠子宮，用注射器損傷大鼠子宮內(nèi)膜。模擬創(chuàng)口后，在大鼠宮腔側(cè)邊注射0.2 ml混合菌液造模，完成后縫合手術(shù)切口，繼續(xù)飼養(yǎng)3周[5]。

1.2.2給藥按照給藥方式不同，將30只造模大鼠分為當(dāng)歸芍藥散組(灌胃給藥1.0g/kg當(dāng)歸芍藥散)，阿奇霉素組(灌胃給藥6.0g/kg阿奇霉素)和模型組，模型組只注射相同量生理鹽水。給藥1次/d，連續(xù)進(jìn)行2周。第14d所有大鼠禁食，第15d常規(guī)注射麻醉，取動脈血3ml，取子宮組織于-80℃保存，頸椎脫臼處死大鼠。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1免疫狀態(tài)大鼠動脈血離心取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測血清促炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-8、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和抗炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-10水平[6]。

1.3.2NF-κB信號通路NF-κB蛋白質(zhì)采用蛋白質(zhì)印跡法檢測，取所有大鼠子宮和卵巢組織100 mg，加入1 ml生理鹽水中勻漿，以5000 r/min 離心處理10min后取上清液，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。在抗體孵育盒中加入3ml 5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，清洗膜3次后轉(zhuǎn)移至4℃，以1∶1000比例與NF-κB一抗混合孵育過夜。回收一抗混合液再次洗滌膜3次，以1∶1000比例加入辣根過氧化物酶二抗混合孵育2 h[7]。孵育完成后取適量行發(fā)光液顯色，再用凝膠成像系統(tǒng)充分曝光，采用Quantity-One軟件計算NF-κB信號通路相關(guān)蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清促炎因子水平對比

血清IL-6、IL-8、TNF-α水平，模型組、當(dāng)歸芍藥散組、阿奇霉素組均高于對照組，但當(dāng)歸芍藥散組與阿奇霉素組無差異但均低于模型組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清促炎因子水平對比

2.2 各組大鼠血清抗炎因子水平對比

血清IL-2、IL-10水平，模型組低于對照組，當(dāng)歸芍藥散組與阿奇霉素組無差異但均高于模型組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清抗炎因子水平對比

2.3 各組子宮組織中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

子宮組織內(nèi)NF-κBp50蛋白、NF-κBp65蛋白水平，模型組高于對照組，當(dāng)歸芍藥散組與阿奇霉素組無差異但均低于模型組(均P<0.05)。見圖1、表3。

表3 各組子宮組織中 NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖1 Western blotting NF-κB表達(dá)

3 討論

在婦科疾病中CPID病情較為頑固且發(fā)病率較高，主要由急性盆腔炎未徹底治療的遷延、濫用抗生素、病菌感染等因素造成，易造成月經(jīng)失調(diào)、白帶異常甚至不孕等不良癥[8-9]。CPID發(fā)病和治療均與患者機(jī)體免疫相關(guān)，因此目前治療多采用抗生素。但長期使用抗生素將出現(xiàn)耐藥性或其他一系列病菌反復(fù)感染問題，對患者長期療效不利[10]。探究新的治療方法對CPID臨床治療尤為重要。

中醫(yī)學(xué)上，CPID相關(guān)的病癥主要?dú)w入“月經(jīng)不調(diào)”、“婦人腹痛”、“不孕”等范疇中，目前臨床采用當(dāng)歸芍藥散中醫(yī)藥方治療。當(dāng)歸芍藥散顧名思義，內(nèi)含當(dāng)歸和芍藥，另有茯苓、澤瀉、川芎、白術(shù)等主要成分，其中當(dāng)歸、芍藥、川芎可舒肝益血，茯苓、白術(shù)、澤瀉可健脾祛濕，諸藥合用共同達(dá)到益氣活血的功效[11-12]。當(dāng)歸芍藥散主要出自《金匱要略》[13]的“婦人妊娠病脈證篇”，論道：“婦人懷妊，腹中癘痛，肝脾不和之證，重用芍藥以斂肝止痛，白術(shù)、茯苓健脾益氣，合澤瀉淡滲利濕，佐當(dāng)歸、川芎調(diào)肝養(yǎng)血...諸藥合用，共奏肝脾兩調(diào)，補(bǔ)虛滲濕之功?！薄端巍ぬ交菝窈蛣┚址健芬灿嘘P(guān)于當(dāng)歸芍藥散治療女性產(chǎn)后血暈，內(nèi)虛氣乏等觀點(diǎn)，而《青州醫(yī)談》則直稱該藥方可妊中保胎。

從病理來看，CPID在治療過程中，子宮內(nèi)炎性因子水平和免疫機(jī)制的平衡至關(guān)重要。炎性因子包括促炎因子和抗炎因子，其合成和分泌與免疫細(xì)胞息息相關(guān)。當(dāng)機(jī)體局部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞等分泌IL-6、IL-8等促炎因子，局部IL-6、IL-8水平明顯升高。同時IL-8結(jié)合趨化因子受體對中性粒細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，調(diào)節(jié)局部炎癥狀態(tài)[14-15]。TNF-α可產(chǎn)生粘附因子并作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，損傷血管功能或形成血栓，同時還有提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力，聚集局部炎性因子，進(jìn)一步惡化局部炎癥狀態(tài)，損傷血管屏障。IL-2、IL-10為抗炎因子，IL-2可促進(jìn)淋巴細(xì)胞的生長、增殖、分化過程，同時還能活化T細(xì)胞，加快啟動免疫機(jī)制；IL-10是公認(rèn)的炎癥與免疫抑制因子，與特異性受體結(jié)合后通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞生長、分化參與局部炎性因子抑制。本研究中，模型組、當(dāng)歸芍藥散組、阿奇霉素組大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于對照組，模型組血清IL-2、IL-10水平低于對照組；當(dāng)歸芍藥散組、阿奇霉素組血清IL-6、IL-8、TNF-α水平低于模型組，IL-2、IL-10水平高于模型組。說明，CPID大鼠機(jī)體存在較明顯的炎癥狀態(tài)，但經(jīng)過當(dāng)歸芍藥散或阿奇霉素治療后，機(jī)體免疫機(jī)制得到有效調(diào)節(jié)，局部炎性因子均顯著抑制[16]。但當(dāng)歸芍藥散組和阿奇霉素組上述指標(biāo)無明顯差異，表明當(dāng)歸芍藥散的炎癥抑制效果和免疫調(diào)節(jié)改善效果也較好，與目前臨床常用的阿奇霉素?zé)o明顯差異。

NF-kB是一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，最常見的為p50/p65二聚體。當(dāng)炎性因子、TNF-α等與特異性受體結(jié)合后，NF-kB可從不同通路下激活激酶并磷酸化，促使NF-kB從細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物中釋放，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄靶基因，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡[17]。本研究中，模型組大鼠子宮組織NF-κBp50蛋白、NF-κBp65蛋白水平高于對照組、當(dāng)歸芍藥散組和阿奇霉素組，而當(dāng)歸芍藥散組和阿奇霉素組無差異。表明，CPID大鼠子宮組織內(nèi)NF-kB信號相關(guān)蛋白表達(dá)活躍，而當(dāng)歸芍藥散可能通過抑制或阻斷NF-kB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)達(dá)到抗炎的效果，進(jìn)而改善CPID大鼠免疫狀態(tài)。

綜上所述，當(dāng)歸芍藥散可通過抑制CPID大鼠NF-kB信號相關(guān)蛋白表達(dá)，降低機(jī)體局部炎癥，改善機(jī)體免疫狀態(tài)。此外，本研究僅從模型組和當(dāng)歸芍藥散、阿奇霉素角度分析CPID大鼠的炎癥狀態(tài)，未對當(dāng)歸芍藥散的使用劑量、時機(jī)等深入分析。因此，為探究當(dāng)歸芍藥散最佳臨床療效，還需擴(kuò)大樣本，改變分組依據(jù)，深入分析不同當(dāng)歸芍藥散用量對CPID大鼠炎癥因子的影響。