歐正陽，鄭進(jìn)萍，李若南，徐 睿，謝懷能，俞道進(jìn)

(福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福建 福州 350002)

鞣花酸(Ellagic acid，EA)是一種廣泛存在于植物中的天然多酚。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道EA在清除自由基、抗突變、抗腫瘤、抗衰老以及抗氧化等方面有突出作用。EA對(duì)腸道上皮細(xì)胞的保護(hù)具有顯著作用，可以維持腸道的生理狀態(tài)，保護(hù)消化功能，促進(jìn)腸道內(nèi)容物中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，防止腸道中的致病菌在腸道上皮細(xì)胞中定殖。EA是親營養(yǎng)素的一種，其最大優(yōu)點(diǎn)是它們不影響腸道菌群，并且沒有停藥期。雖然關(guān)于EA的功能和作用上的研究眾多，但是關(guān)于EA對(duì)于IPEC-J2凋亡方面的研究還未見報(bào)道。

Bcl-2和Bax都是Bcl-2家族的成員，Bcl-2具有抑制凋亡的作用，而Bax具有促進(jìn)凋亡的作用。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)關(guān)鍵酶，Bcl-2通過抑制pro-Caspase-3激活成為cle-Caspase-3，起到抑制凋亡的作用，同時(shí)cle-Caspase-3的激活量受到Bcl-2/Bax比率的影響。本試驗(yàn)檢測(cè)EA對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，采用四甲基偶氮鹽(MTT)法，流式細(xì)胞儀測(cè)定IPEC-J2細(xì)胞凋亡率，ELISA法檢測(cè)Bcl-2、Bax和cle-Caspase-3的表達(dá)情況。本研究通過探討EA對(duì)細(xì)胞Bcl-2，Bax，cle-Caspase-3的表達(dá)量與細(xì)胞的抗凋亡能力之間的關(guān)系，進(jìn)一步了解關(guān)于EA抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為今后更好開發(fā)和利用EA提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

ELISA試劑盒、EA(用0.01 μg/mL NaOH溶液現(xiàn)配現(xiàn)用)，購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA(中)細(xì)胞裂解液(含抑制劑)，均購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；胰蛋白酶、胎牛血清(FCS)、DMEM/F12培養(yǎng)基，均購自HyClone公司；IPEC-J2，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；二甲基亞礬，購自Amersco公司。

1.2 主要儀器

HERA cell 150細(xì)胞培養(yǎng)箱、EVOS FLC 倒置生物顯微鏡，購自美國Thermo公司；凈化工作臺(tái)，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；GloMax96孔多功能發(fā)光檢測(cè)儀，購自美國Promega公司；流式細(xì)胞儀，購自森生物(杭州)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)液使用含10% FBS、1%谷氨酰胺、青鏈雙抗和90%的DMEM/F12空白培養(yǎng)基，隔天需要更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到80%時(shí)，將其用含有0.25%EDTA的胰蛋白酶消化并傳代。將培養(yǎng)瓶放于CO培養(yǎng)箱中(37 ℃，95%濕度，5%CO)，定期觀察細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)情況。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)

采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)5個(gè)濃度梯度組，其中空白對(duì)照組1組，EA處理組4組，每組重復(fù)5個(gè)，濃度分別為20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL。取生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期細(xì)胞，將其進(jìn)行消化計(jì)數(shù)后接種于96孔板中，保證每個(gè)孔中細(xì)胞量為0.1 mL(1×10個(gè)/孔)，等細(xì)胞貼壁后將原培養(yǎng)基去除，然后使用PBS溶液洗滌，依照試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入含有不同濃度的EA的完全培養(yǎng)基，孵育12 h。培養(yǎng)結(jié)束后，先向96孔板中加入10 μL MTT(MTT的終濃度為0.5 mg / mL)，然后繼續(xù)在37 ℃的避光環(huán)境中孵育4 h，最后添加150 μL DMSO，并振蕩10 min,其目的是為了更好地溶解甲瓚，于設(shè)置波長(zhǎng)為490 nm的酶標(biāo)儀上，讀取OD值。

1.5 AO/EB雙熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將消化后的細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)，48h后用PBS溶液洗滌一次，依照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入含不同藥物濃度的EA，培養(yǎng)12h，然后將含有混勻的AO 染液(10 μg/mL)和EB染液(10 μg/mL)的1 mL PBS加入6孔板中，在避光環(huán)境中孵育5～15 min后，用倒置生物顯微鏡觀察并拍照。

1.6 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

將消化后的細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)，48 h后用PBS溶液洗滌一次，依照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入含不同藥物濃度的培養(yǎng)基，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞6 min并收集細(xì)胞，2 000 rpm/min離心5 min，去除上清液，用PBS洗滌2次，每洗滌一次后2 000 rpm/min離心5 min，收集1×10個(gè)細(xì)胞；加入500 μg的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μg Annexin V-FITC混勻后，加入5 μg Propidium，混勻。將其放在室溫避光的環(huán)境中，反應(yīng)時(shí)間為5～15 min，最后放入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 ELISA檢測(cè)Bcl-2、Bax和cle-Caspase-3的表達(dá)

根據(jù)1.3處理細(xì)胞后，吸取上清液作為樣品，4 ℃情況下短期保存待測(cè)，按照ELISA檢測(cè)試劑盒的說明檢測(cè)Bcl-2、Bax和cle-Caspase-3的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用NovoExpress軟件對(duì)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析,以SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，<0.05為差異顯著、<0.01為差異極顯著、>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EA對(duì)IPEC-J2生長(zhǎng)作用的影響

與空白對(duì)照組相比，各濃度的EA作用IPEC-J2 12 h后，促生長(zhǎng)作用有所不同(見圖1)；濃度為20 μg/mL的EA對(duì)IPEC-J2促生長(zhǎng)效果不顯著(>0.05)；濃度為40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL時(shí)差異極顯著(<0.01)；濃度為80 μg/mL時(shí)，與其他作用濃度相比都具有顯著性差異(<0.05)。上述結(jié)果表明，EA能夠劑量依賴性地促進(jìn)IPEC-J2的生長(zhǎng)。

圖1 EA對(duì)正常培養(yǎng)的IPEC-J2生長(zhǎng)的作用小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。Fig. 1 Effects of EA on normal cultured IPEC-J2 proliferationDifferent lowercase letters indicate significant difference (P<0.05),the same letters indicate no significant difference (P>0.05).

2.2 EA對(duì)IPEC-J2細(xì)胞凋亡的影響

2.2.1 AO/EB雙熒光染色法檢測(cè)結(jié)果 在AO/EB雙熒光染色下，核染色質(zhì)呈綠色的是結(jié)構(gòu)正常的細(xì)胞，核染色質(zhì)呈橙紅色的為凋亡細(xì)胞。由圖2可見，空白對(duì)照組IPEC-J2 培養(yǎng)12 h后，視野中凋亡細(xì)胞數(shù)為12個(gè)，濃度為20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL的EA作用IPEC-J2 12 h后，視野中凋亡細(xì)胞數(shù)分別為6個(gè)、4個(gè)、1個(gè)和0個(gè)，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。上述結(jié)果表明增加EA的濃度后，IPEC-J2的凋亡細(xì)胞減少，EA起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。

2.2.2 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果 從圖3可以看到，空白對(duì)照組中第2象限的細(xì)胞數(shù)量更多。但隨著EA濃度的增加，發(fā)現(xiàn)第2象限細(xì)胞減少。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度EA作用IPEC-J2 12 h，細(xì)胞的凋亡率逐漸降低(見圖4)；濃度為20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL時(shí)達(dá)到差異極顯著(<0.01)；濃度20 μg/mL與40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL的凋亡率抑制差異均顯著(<0.05)，60 μg/mL與80 μg/mL差異不顯著(>0.05)。以上結(jié)果表明，隨著EA濃度增加，IPEC-J2的凋亡率逐漸降低。

圖2 倒置熒光顯微鏡下觀察EA抑制IPEC-J2凋亡Fig. 2 EA inhibited apoptosis of IPEC-J2 under fluorescence microscope

圖3 不同濃度EA對(duì)IEPC-J2 細(xì)胞凋亡率影響的流式細(xì)胞圖Fig. 3 Effect of different concentration of EA on apoptosis rate of IEPC-J2 cells detected by flow cytometry

圖4 EA對(duì)IPEC-J2凋亡的影響Fig. 4 `Effect of EA on apoptosis of IPEC-J2

2.3 EA對(duì)IPEC-J2 Bcl-2、Bax、cle-Caspase-3含量的影響

采用ELISA法測(cè)定Bcl-2、Bax、cle-Caspase-3的含量(見表1)，與空白對(duì)照組相比，Bax、cle-Caspase-3均降低，差異顯著(<0.05，或<0.01)；Bcl-2/Bax上升，差異極顯著(<0.01)。與空白對(duì)照組相比，EA作用IPEC-J2后，各加藥組Bcl-2的含量略有降低，但差異不顯著(>0.05)，各加藥組之間表現(xiàn)為差異不顯著(>0.05)。各加藥組Bax含量較空白對(duì)照組相比，差異顯著(<0.05，或<0.01)，20 μg/mL組與其他加藥組之間，差異顯著(<0.05)；40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL加藥組之間差異不顯著(>0.05)。各加藥組Bcl-2/Bax含量較空白對(duì)照組相比，差異顯著(<0.05)，但各加藥組相互間差異并不顯著(P>0.05)。各加藥組cle-Caspase-3含量較空白對(duì)照組相比，差異顯著(<0.05，或<0.01)，20 μg/mL組與其他加藥組之間，差異極顯著(<0.01)；40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL加藥組之間差異不顯著(>0.05)。

表1 鞣花酸對(duì)IPEC-J2 Bcl-2、Bax、cle-Caspase-3含量的影響(n=3)Table 1 The effect of ellagic acid on the content of Bcl-2, Bax, cle-Caspase-3 in IPEC-J2

3 討 論

在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，鞣花酸具有抗誘變、抗氧化、抗炎活性以及抗細(xì)胞凋亡等多種生物活性功能。Galano等發(fā)現(xiàn)EA的抗氧化活性可抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡在維持細(xì)胞總體數(shù)量上具有重要作用，而小腸上皮細(xì)胞，作為動(dòng)物體內(nèi)關(guān)鍵的吸收細(xì)胞，對(duì)腸道免疫調(diào)控以及營養(yǎng)吸收等方面起到關(guān)鍵的作用。本研究采用的IPEC-J2細(xì)胞系目前在篩選益生菌、研究腸道炎癥和免疫以及霉菌毒素等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，因此研究EA對(duì)IPEC-J2細(xì)胞系的作用具有重要意義。

細(xì)胞凋亡被視為是一系列高度調(diào)控Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)事件的結(jié)果。在整個(gè)細(xì)胞凋亡的過程中，Caspase-3作為凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游因子，是最為關(guān)鍵的效應(yīng)型Caspase。研究表明，當(dāng)pro-Caspase-3激活成為cle-Caspase-3標(biāo)志著細(xì)胞的凋亡進(jìn)入到了不可逆轉(zhuǎn)的階段。被激活的cle-Caspase-3通過特異地水解細(xì)胞中的一系列底物而導(dǎo)致細(xì)胞解體。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，EA 對(duì)cle-Caspase-3表達(dá)量的降低效果與空白對(duì)照組相比具有顯著差異，表明cle-Caspase-3在IPEC-J2中的表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡受到抑制。

Bax受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)便從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至線粒體并與線粒體膜結(jié)合，再與位于線粒體膜上的Bcl-2作用從而發(fā)揮促凋亡作用。崔偉倫等通過設(shè)計(jì) Bax 抑制因子，研究其對(duì)新生大鼠腸組織的保護(hù)作用，研究發(fā)現(xiàn)適量的Bax抑制肽可以通過降低Caspase-3的活性、保護(hù)細(xì)胞的線粒體膜，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)腸上皮細(xì)胞起到保護(hù)作用。而本研究結(jié)果同樣顯示，EA對(duì) IPEC-J2 細(xì)胞Bax的表達(dá)具有明顯的抑制作用，表明鞣花酸對(duì) IPEC-J2 細(xì)胞的保護(hù)作用可能和Bax的下調(diào)存在一定的關(guān)聯(lián)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過不同劑量EA作用IPEC-J2 12h后，EA作用劑量越大，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度越快，且細(xì)胞的凋亡率明顯下降，提示EA對(duì)IPEC-J2的凋亡具有一定的抑制效果。