李村院, 李曉悅, 劉 夏,夏咸柱,喬 軍,胡圣偉*

(1. 石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2. 石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長春獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122)

我國作為農(nóng)業(yè)大國，每年的秸稈產(chǎn)量十分可觀，纖維素作為秸稈的主要成分，具有難以降解的結(jié)構(gòu)特點，導(dǎo)致其利用率非常有限。絕大部分秸稈直接在田間進(jìn)行焚燒處理或因無法分解利用而廢棄，這不僅極大程度上降低了秸稈資源的有效利用率，并給自然環(huán)境帶來巨大威脅。因此，如何將纖維素轉(zhuǎn)化為可利用的能源一直是人類不斷探索的課題。目前降解纖維素主要采用反應(yīng)條件溫和且無污染的生物法，即利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶降解纖維素。細(xì)菌由于具有生長速度快、操作簡單、大規(guī)模培養(yǎng)成本低等優(yōu)勢而被廣泛用于生產(chǎn)纖維素酶。因此，從自然界中篩選出能夠高效降解纖維素的細(xì)菌一直是研究的熱點。

馬作為典型的后腸消化型食草動物，由于其具有役用、賽用、乳用和肉用等多種重要的用途而被廣泛飼養(yǎng)在全球各地，其膨大的盲腸中共生了大量的微生物，在消化纖維素的過程中發(fā)揮了巨大的功能。同時，有研究表明在消化相同飼草的時候，后腸消化型動物比反芻類動物釋放更少的甲烷和氫氣，對環(huán)境更加友好。目前，已有大量研究報道，分別從梅花鹿、竹鼠、雙峰駝、小龍蝦、牦牛、羊、藏豬、鵝、大熊貓等多種動物的胃腸道或糞便中分離出了纖維素降解菌。然而，目前對馬盲腸中微生物的研究相對匱乏。因此，深入研究馬盲腸中的纖維素降解菌可能會為應(yīng)對環(huán)境危機、能源危機、新型益生菌的開發(fā)等方面提供新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本的采集

樣本來源于昌吉市木壘縣馬場的18匹健康伊犁馬的盲腸內(nèi)容物，樣本采集后快速放入滅菌的50 mL離心管中，并存放于車載冰箱中在4 ℃的條件下帶回實驗室用于纖維素分解菌的分離培養(yǎng)。

1.2 儀器設(shè)備

高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、烘箱、電子天平、離心機、水浴鍋、PCR儀、微波爐、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、-20 ℃冰箱、-80 ℃冰箱、磁力攪拌器、移液器。

1.3 纖維素分解菌的分離純化

將采集的18個伊犁馬盲腸內(nèi)容物樣本置于超凈工作臺中，取一個無菌三角瓶，每個樣品稱取0.1 g，共1.8 g置于三角瓶內(nèi)，并于三角瓶內(nèi)加入180 mL生理鹽水混合均勻，在磁力攪拌器上均勻攪拌30 min，然后取一支無菌EP管，吸取攪拌后的糞便1 mL，即為10菌懸液，然后再取6支無菌EP管依次進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋(10～10)，一共6個梯度，每個梯度吸取100 μL菌懸液均勻涂布在CMC-Na篩選培養(yǎng)基上，每個梯度做3個平行，并于37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后觀察培養(yǎng)皿中菌落生長狀態(tài)。

挑選一個菌落生長合適的梯度，用接種針將該梯度培養(yǎng)基上所有的單菌落點種于LB發(fā)酵固體培養(yǎng)基上并做好標(biāo)記，于37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后，用1 mg/mL剛果紅染色液染色1 h，再用1 mol/L NaCl溶液脫色30 min，觀察菌落周邊是否形成透明水解圈，測量每個單菌落的直徑d和水解圈直徑D，記錄數(shù)據(jù)并計算水解圈與菌落直徑的比值(D/d)。比值越大代表纖維素降解能力越強，選取水解圈直徑與單菌落直徑比值較大的菌株，進(jìn)行劃線純化3次，然后在菌株的液體純培養(yǎng)物中加入等體積的50%的甘油，于-80 ℃冰箱中長期凍存。

1.4 纖維素分解菌的復(fù)篩

從-80 ℃冰箱中取出凍存的菌株，接種于LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃，180 r/min過夜震蕩培養(yǎng)，然后再以1%的比例接種到LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二次活化，待菌液的D達(dá)到1.0時吸取2 mL接種到20 mL LB發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)48 h后，6 000 r/min離心15 min收集上清液，即為纖維素酶活測定的粗酶液。

1.5 CMCase(羧甲基纖維素酶)活力的測定

1.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用10 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制0.1 mg/mL～0.5 mg/mL的葡萄糖溶液，0 mg/mL的葡萄糖溶液為空白對照，取不同濃度的葡萄糖溶液各2 mL分別加入6支試管中，再依次加入2 mL蒸餾水和5 mL DNS溶液(索萊寶，北京)，將上述溶液混合均勻后于沸水浴中煮沸5 min，冷卻至室溫后用蒸餾水定容至25 mL，混勻后在540 nm波長處測定吸光度值。以吸光度值為Y軸，葡萄糖含量為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 酶活力測定步驟 將含1% CMC-Na的0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(0.05 mol/L檸檬酸鈉54 mL、0.05 mol/L檸檬酸46 mL、CMC-Na 1 g、調(diào)pH至4.8)做為底物測定酶活性。反應(yīng)混合物中包含0.5 mL底物溶液和0.5 mL酶溶液。在50 ℃下反應(yīng)30 min，在反應(yīng)混合物中加入1.25 mL DNS溶液停止反應(yīng)。然后將反應(yīng)混合物在100 ℃下煮沸5 min。用分光光度計測定D值。所得值與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。

式中：A為酶反應(yīng)液的吸光度值；A為空白對照的吸光度值；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；V為底物溶液的體積(mL)；t為酶解反應(yīng)時間(min)，1000為轉(zhuǎn)化因子(1 mmol=1 μmol)。

1.6 纖維素分解菌生化特征的測定

根據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊對酶活力最高的前5株纖維素分解菌進(jìn)行生理生化鑒定。將對數(shù)生長期的菌液接種至分別含0.5%葡萄糖、0.5%乳糖、0.5%半乳糖、0.5%麥芽糖、0.5%蔗糖、0.5%甘露醇、0.5%山梨醇、0.5%菊糖、0.5%纖維二糖、0.5%玉米支鏈淀粉的糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)(日本生物，青島)，并于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后添加溴甲酚紫指示劑，觀察顏色變化，紫色為陰性，黃色為陽性。同時，將對數(shù)生長期的菌液接種至不同固體培養(yǎng)基上(溴甲酚綠、七葉苷)，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后并觀察結(jié)果，不變色為陰性，溴甲酚綠變黃為陽性，七葉苷變黑為陽性。分別將新鮮的菌液穿刺于含LB發(fā)酵固體培養(yǎng)基的試管中和接種于含LB發(fā)酵液體培養(yǎng)基的密封注射器中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別觀察菌株的運動情況和產(chǎn)氣情況。

1.7 纖維素分解菌生長特性

配制LB培養(yǎng)基，將菌液以1%的比例接種于液體LB培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床中震蕩培養(yǎng)，每隔2 h取菌液1 mL于600 nm波長處測定吸光度值，以未接菌的培養(yǎng)基作為空白對照，繪制生長曲線。

1.8 纖維素分解菌的16S rDNA分子鑒定

使用16S通用引物27F(5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增體系包括： PrimeSTAR Max Premix (2×) 10 μL(Takara，大連)，上下游引物各0.5 μL，菌液0.2 μL，Nuclease-Free ddHO 8.8 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 3 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，確定產(chǎn)生大小正確且單一的條帶后，將其送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。測序后的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析，確定種屬關(guān)系，然后用MEGA 7.0軟件中的鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌的初篩

由表1可見，具有水解圈且D/d≥2的纖維素分解菌共計66株，其中CE83菌株的水解圈直徑與菌落直徑的比值最大，為3.67。

2.2 纖維素分解菌的復(fù)篩

酶活力的測定結(jié)果見表2。由表2可見，其中CE207酶活最高，達(dá)到14.81 U/mL，CE105酶活最低，為1.91 U/mL。

2.3 纖維素分解菌生化特征的測定

由表3可知，菌株CE3、CE41、CE83、CE176、CE207均可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、菊糖、纖維二糖、玉米支鏈淀粉，同時均能產(chǎn)酸，不能產(chǎn)氣、不具有運動能力。此外，除CE41不能發(fā)酵半乳糖外，其余菌株均可。除CE3和CE41不能發(fā)酵七葉苷之外，其余菌株均可。

2.4 纖維素分解菌生長曲線的測定

由圖1可知，CE3、CE41、CE83、CE176、CE207五株菌的生長情況有所差別，CE3在10 h左右到達(dá)生長平臺期；CE41在20 h左右到達(dá)生長平臺期；CE83和CE176在8 h左右到達(dá)生長平臺期，CE207在10 h左右到達(dá)生長平臺期。CE3、CE176和CE207在18 h后菌液濃度有所下降。CE41、CE83和CE207平臺期濃度大于CE3和CE176。

表1 纖維素分解菌的水解圈直徑與菌落直徑的比值Table 1 The hydrolysis circle diameter and colony diameter of cellulose decomposing bacteria and its ratio cm

表2 酶活力測定Table 2 Enzyme activity determination U/mL

表3 生化特征測定Table 3 Determination of biochemical characteristics

圖1 纖維素降解菌的生長曲線Fig. 1 Growth curve of cellulose-degrading bacteria

2.5 纖維素分解菌的分子學(xué)鑒定

采用基因測序技術(shù)對以上66個菌株進(jìn)行分子學(xué)鑒定，使用細(xì)菌通用引物擴增出一條長度約為1600 bp左右的單一條帶，將測序獲得的序列在NCBI中進(jìn)行Blast比對，選擇數(shù)據(jù)庫中相似度最高的序列作為菌株鑒定的最終結(jié)果。比對結(jié)果顯示為大腸桿菌、短小芽孢桿菌、高地芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、莫來芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、同溫層芽孢桿菌、維爾茲芽孢桿菌、漳州芽孢桿菌。系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可知，CE3、CE41、CE83、CE176、CE207位于一個大的分支上，CE3、CE41與短小芽孢桿菌的遺傳距離最近，CE83、CE176、CE207與漳州芽孢桿菌的遺傳距離最近。

圖2 纖維素分解菌的進(jìn)化樹Fig. 2 An evolutionary tree of cellulolytic bacteria

3 討 論

纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分，是公認(rèn)的自然界中儲量最豐富也最廉價的可再生有機物質(zhì)資源。纖維素酶是一種高活性的生物催化劑，能將天然纖維素降解成短鏈的小分子物質(zhì)，最終轉(zhuǎn)化為纖維二糖或單糖，從而提高飼料中纖維類物質(zhì)的利用率，既可節(jié)約飼料資源，又可減少養(yǎng)殖業(yè)的排泄，對環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展也起到一定的作用。自然界中纖維素酶的來源有三種，一種存在于植物的不同生長發(fā)育過程中；一種是動物來源的纖維素酶；另外一種來源于微生物，如細(xì)菌、真菌、放線菌等，它是人類最早認(rèn)識的纖維素酶，其中微生物是纖維素酶最主要的來源。馬作為大型草食性動物，腸道中的微生物尤其是盲腸中的微生物與其出色的纖維素消化能力有著密不可分的關(guān)系。馬盲腸是馬消化纖維素的主要器官，是微生物種類最多、分布最廣的部位，也是細(xì)菌發(fā)酵的主要場所，纖維含量高的植物飼料在馬的后腸通過微生物細(xì)菌發(fā)酵被降解為揮發(fā)性脂肪酸和短鏈脂肪酸等利于機體吸收的物質(zhì)，因此盲腸被稱為馬匹的“發(fā)酵罐”。

本研究以CMC-Na為唯一碳源，篩選具備纖維素分解能力的細(xì)菌菌株，再通過剛果紅染色后產(chǎn)生的水解圈與菌株的直徑比值初步判斷菌株的產(chǎn)酶能力，由于該方法快捷簡單，成本低廉，因此被大多數(shù)研究者廣泛采用。但是CMC-Na平板篩選法不能精準(zhǔn)定量菌株產(chǎn)纖維素酶能力的大小，因此需要對初篩得到的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，然后測量菌株的纖維素酶活性，根據(jù)酶活的高低進(jìn)行復(fù)篩。試驗初期，在CMC-Na平板上初篩得到D/d≥2的菌株共計66株，較多數(shù)量的富含纖維素降解酶的菌再次表明這些菌株在馬的粗纖維飲食中受到了強烈的選擇。根據(jù)酶活的高低挑選了5株高產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)勢菌株，并對其進(jìn)行生化特征和生長曲線的測定以及16S rDNA分子學(xué)鑒定。發(fā)現(xiàn)這5株菌具有良好的生長性能，基本在接種8 h后可以迅速達(dá)到平臺期；可以降解包括葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、菊糖、纖維二糖、玉米支鏈淀粉在內(nèi)的多種底物。廣泛的底物適應(yīng)性和快速的生長能力也表明這5株菌株是馬盲腸中降解纖維素的優(yōu)勢菌株。進(jìn)一步利用系統(tǒng)發(fā)育分析表明這5株細(xì)菌均為芽孢桿菌屬細(xì)菌，CE41和CE83被鑒定為，CE90、CE176和CE207被鑒定為。其中漳州芽孢桿菌(CE207，14.81 U/mL)具有最高的產(chǎn)纖維素酶的能力。已有研究表明纖維素降解能力較強的菌株大多是芽孢桿菌。本研究從伊犁馬盲腸中分離出的菌株除大腸桿菌外基本均為芽孢桿菌屬細(xì)菌，該結(jié)果與其一致。蘇少鋒等從蒙古馬盲腸內(nèi)容物中分離篩選得到一株具有較高降解纖維素能力的解淀粉芽孢桿菌，酶活力為0.6 U/mL。Shakarami等從阿拉伯馬的糞便中分離得到四株高產(chǎn)纖維素酶的纖維素分解菌，酶活最高的一株是多粘類芽孢桿菌(2.95 U/mL)。但是本研究分離的漳州芽孢桿菌具有更高的酶活，這可能與采樣時期、樣本來源以及采樣時飼喂的高纖維素含量的粗飼料等有一定的關(guān)系。未來深入研究該菌株的產(chǎn)酶能力和其它的生物學(xué)功能具有較高的研究價值和實踐價值。

4 結(jié) 論

本研究從伊犁馬盲腸內(nèi)容物中分離出66株好氧纖維素降解菌，主要為大腸桿菌和各類芽孢桿菌。