朱大偉，白延紅，郭家俊，文成龍，楊 瑞，胡建宏*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100；2. 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

雄性生殖干細胞，即精原干細胞(Spermatogenic stem cells, SSCs)是雄性哺乳動物體內(nèi)僅有的一種能將遺傳信息傳遞給后代的二倍體細胞，定位于曲細精管的基底膜部位。目前關(guān)于SSCs的研究已從嚙齒類動物逐漸發(fā)展到牛、羊等大型家畜和靈長類動物，研究內(nèi)容也涉及分離、純化、體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化等多個方面。本文參考目前對SSCs誘導(dǎo)分化的研究，對SSCs誘導(dǎo)分化的方法和機理進行綜述，以期為雄性動物輔助生殖和畜牧業(yè)生產(chǎn)方面的研究提供參考。

1 SSCs的生物學(xué)特性

SSCs定植于曲細精管的基底部，為圓形或卵圓形，細胞器除核糖體和線粒體外都不發(fā)達。SSCs核內(nèi)染色質(zhì)含量豐富且均勻，胞質(zhì)分裂不完全，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，染色質(zhì)呈深藍或藍紫色，胞質(zhì)呈淺藍色。SSCs生存所需的微環(huán)境主要由睪丸支持細胞、管周肌樣細胞和間質(zhì)細胞維持，若SSCs脫離該微環(huán)境將失去其生物學(xué)特性。SSCs擁有增殖、分化和自我更新的潛能。對小鼠而言，精原細胞可分為三類，即A型、中間型和B型，而A型精原細胞按照形態(tài)不同又可劃分成Asingle(As)型、Apaired(Apr)型、Aaligned(Aal)型、以及A1～A4型，其中前三種屬于未分化型，一般認為As型精原細胞是SSCs，在睪丸中僅占生殖細胞總數(shù)的0.02%～0.03%。然而隨著組織移植技術(shù)的研究，發(fā)現(xiàn)As型精原細胞中真正具有增殖和分化潛能的只有10%左右，而Apr型和Aal型精原細胞中的一部分也具有自我更新的潛能。

2 SSCs的檢測與鑒定

SSCs數(shù)量極少，僅占睪丸中生殖細胞總數(shù)的0.02%～0.03%左右，因此對SSCs的檢測與鑒定成為影響SSCs分離與純化效率的重要因素。目前已發(fā)現(xiàn)且較為公認的可作為SSCs特異性標志物的有GFRα1、PLZF、CDH1等。謝靜靜等使用差異貼壁純化法對獲得的綿羊生殖細胞進行培養(yǎng)，3 d后將未貼壁的細胞取出以PLZF作為SSCs特異性標記進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示存在PLZF陽性。陳鑫蘋等采集年齡為2歲14 d的食蟹猴的單側(cè)睪丸，經(jīng)過三步酶消化法和差異貼壁法富集SSCs，經(jīng)過20 d的培養(yǎng)后進行CDH1標記分子免疫熒光染色和RT-PCR檢測，結(jié)果均顯示為陽性。

3 SSCs的誘導(dǎo)分化方法

不同種類動物SSCs分化為精子所需的條件不盡相同，SSCs體外增殖所必要的因子及培養(yǎng)條件尚待完善，因此目前除了嚙齒動物外，大多數(shù)哺乳動物并未建立長久的SSCs體外培養(yǎng)體系?，F(xiàn)今SSCs主要有兩種定向誘導(dǎo)分化的方法：一是試劑誘導(dǎo)，即在培養(yǎng)基中加入各種定向分化所需要的營養(yǎng)物質(zhì)和激素等，人工創(chuàng)造SSCs分化條件，例如視黃酸(retinoic acid, RA)對于維持雄性個體精子發(fā)生具有重要作用，而維生素A的活性代謝產(chǎn)物就是RA，在培養(yǎng)液中添加維生素可起到促進精原細胞分化的作用。Wang等分別使用1 nM、10 nM、100 nM和1 uM的RA處理小鼠精原干細胞0、12、24、36 h并通過RNA測序技術(shù)檢測參與精原細胞分化或減數(shù)分裂的相關(guān)基因8、-的mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)100 nM和24 h的處理效果最好，且誘導(dǎo)3 d后能漸進性的誘導(dǎo)出細線期的精母細胞；李金梅等發(fā)現(xiàn)在哺乳動物的精原干細胞中不存在雄激素受體(androgen receptor,AR)，但是支持細胞中存在AR，通過向精原干細胞-支持細胞體外共培養(yǎng)體系中添加二氫睪酮或雄激素拮抗劑，16 h后進行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)雄激素拮抗劑的處理組中AR和Wt-1表達明顯降低而Plzf表達升高，而向6周齡的小鼠腹腔注射20 mg/kg劑量的雄激素拮抗劑后發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸中精母細胞和精子的數(shù)量顯著降低而Plzf陽性細胞數(shù)量增加,這些結(jié)果表明雄激素能夠通過間接調(diào)控精原細胞的PLZF、Wt-1通路控制精原細胞的增殖、分化過程；Fahar等研究發(fā)現(xiàn)將從2～12歲的青春期前男孩體內(nèi)獲取的1 mm凍融睪丸碎片放在加入補充了5 IU/L FSH的KSR培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 d后能得到圓形精子細胞，而當(dāng)FSH濃度增加到50 IU/L時無法誘導(dǎo)生殖細胞的分化。二是通過移植或基因修飾誘導(dǎo)，將分離、純化后的SSCs移植入受體動物的生精小管內(nèi)，繼續(xù)增殖分化，又包括同基因移植和異基因移植兩種方式，同基因移植是指將自身的SSCs重新移植入自身睪丸內(nèi)，異基因移植是指將SSCs在同種動物的不同個體間移植。Shetty等從3只青春期和一只青春期前的恒河猴的睪丸薄壁組織中回收到生殖細胞，經(jīng)過特殊處理后，將從青春期恒河猴睪丸中獲取的細胞混合后均勻分配給受體恒河猴，將從青春期前恒河猴睪丸中獲得的生殖細胞分配給對照組恒河猴，采用超聲引導(dǎo)法將生殖細胞注射入生殖干細胞功能受損的受體恒河猴睪丸網(wǎng)，移植后20～38周后，部分接受移植的恒河猴精液中有精子出現(xiàn)。田稼等將體外培養(yǎng)的小鼠SSCs進行GFP+慢病毒轉(zhuǎn)染，待轉(zhuǎn)染的細胞中表達GFP蛋白后將其移植入異體小鼠的曲細精管中，3周后對受體小鼠的睪丸組織切片進行免疫熒光染色，能觀察到顯示綠色熒光的GFPSSCs定植于曲細精管基底部，10周后在曲細精管腔內(nèi)能觀察到顯示GFP的生精細胞和成熟精子。

4 SSCs的分化機理

SSCs的分化受多種細胞因子的協(xié)調(diào)作用，在SSCs的分化過程中有3個重要的過程：As型精原細胞分化為Apr型精原細胞、Aal型精原細胞分化為A1型精原細胞以及A1型精原細胞分化為B型精原細胞，之后B型精原細胞進入減數(shù)分裂最終形成成熟的精子細胞。

4.1 細胞因子調(diào)控機制

視黃酸(RA)是由支持細胞和生精細胞產(chǎn)生，能夠在精原細胞的分化和減數(shù)分裂中起調(diào)控作用的細胞因子。RA通過與細胞核內(nèi)不同的受體相結(jié)合，可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄變化，如減數(shù)分裂相關(guān)基因8和4的表達量增加。RA/Stra8通路在精子發(fā)生過程中起到兩種不同的作用，一是促進精原細胞開始分化，二是促進細胞進入減數(shù)分裂狀態(tài)。謝慧等研究表明，使用RA處理小鼠SSCs能夠通過降低與甲基化相關(guān)基因1和3的表達量來促進SSCs進入分化過程；而來自精原細胞分泌的RA可通過自分泌方式調(diào)控Stra8直接介導(dǎo)減數(shù)分裂的開始。Busada等研究發(fā)現(xiàn)，RA能作用于PI3K/Akt/ mTOR 信號通路進而影響SSC分化中的關(guān)鍵基因-基因的mRNA的翻譯水平；同時當(dāng)使用雷帕霉素阻斷該信號通路后，RA介導(dǎo)的基因mRNA的翻譯受阻，可導(dǎo)致精原細胞分化障礙。Yang等研究表明，支持細胞還能通過分泌骨形成蛋白 4(BMP4)參與對精原細胞分化的調(diào)控過程，BMPR1A 和 BMP Ⅱ是蘇氨酸/色氨酸激酶受體，主要在不同時期精原細胞上表達，BMP4通過與BMPR1A和BMP Ⅱ結(jié)合可參與精原細胞的分化調(diào)控過程。BMP4還能通過協(xié)同作用與RA一起影響8和的表達，進而促進精原細胞的分化。

此外，由支持細胞產(chǎn)生的干細胞因子(stem cell factor，SCF)也能與產(chǎn)生作用，共同控制精原細胞的分化和減數(shù)分裂過程。對小鼠而言，如果基因表達發(fā)生障礙，會引起精原細胞分化受阻，睪丸中僅含有As型、Apr型和Aal型等原始精原細胞，而重組SCF后可重新恢復(fù)正常的分化過程。

4.2 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機制

Stat3是一種存在于精原細胞中的重要的調(diào)控自我更新和分化的因子，Stat3受到抑制后，SSCs的分化產(chǎn)生障礙，引起未分化SSCs堆積。目前關(guān)于Stat3的作用機理并不是很明確，僅有研究發(fā)現(xiàn)表達于精原細胞中的神經(jīng)原素3(3)是它的一個重要靶點，在睪丸中Ngn3的表達水平隨著精原細胞的分化而增加，Stat3通過與3基因的啟動子和增強子相結(jié)合增強其表達，高度表達的Ngn3能增強Stra8和SSCs分化標志物CD117的表達量，而抑制促增殖因子-早幼粒鋅指基因()的表達，從而加速精子發(fā)生和減數(shù)分裂過程；此外維持SSCs未分化狀態(tài)的必需物GDNF能通過抑制3的磷酸化進而抑制3的表達水平，這可能意味著Stat3/Ngn3通路對SSCs的分化具有重要作用。

Sohlh1/2是特異性表達于生精細胞中的bHLH家族成員，Sohlh1和Sohlh2間既具有相互調(diào)節(jié)作用又有協(xié)同作用。Sohlh1和Sohlh2能夠直接結(jié)合在精原細胞基因的啟動子區(qū)并使其表達量上調(diào)，進而激活相關(guān)信號通路，促進SSCs的分化；12單敲除或雙敲除的小鼠中，精原細胞形態(tài)出現(xiàn)異常，且未分化的A型精原細胞將不能分化為陽性精原細胞，但是一部分精原細胞可能會過早的進行減數(shù)分裂，這可能是因為12的缺失會導(dǎo)致部分細胞中Stra8表達量增加。

4.3 miRNA的調(diào)控機制

微小RNA(microRNA, miRNA)是一種對內(nèi)源性基因具有調(diào)節(jié)作用的非編碼小RNA，依靠降解靶基因或抑制靶基因的表達而發(fā)揮其調(diào)控功能，miRNA對正常精子的發(fā)生具有重要作用。miRNA-202高度表達于SSCs中，且接受RA和GDNF的反向調(diào)控。Chen等的研究發(fā)現(xiàn)，使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除miRNA-202后SSCs數(shù)量與對照組相比減少了60%，出現(xiàn)凋亡增加和過早分化現(xiàn)象，而miRNA-202的靶基因2對減數(shù)分裂的啟動具有重要作用，說明miRNA-202對SSCs的分化具有重要調(diào)控作用。Niu等發(fā)現(xiàn)miRNA204在49陰性的細胞中表達量較高，能直接作用1基因且抑制其表達，而被抑制的Sirt1會導(dǎo)致與SSCs自我更新和增殖相關(guān)的基因如、4的表達量下降，最終促進SSCs的分化。Cui等通過RT-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-224是一種高度表達于小鼠SSCs中的表觀調(diào)控因子，當(dāng)使用陰性對照小RNA、miRNA-224抑制劑和miRNA-224對照分別轉(zhuǎn)染小鼠SSCs時發(fā)現(xiàn)miRNA-224對照能顯著增加SSCs的數(shù)量以及SSCs中的1和的mRNA和蛋白水平，而miRNA-224抑制劑會減少SSCs的數(shù)量同時降低1和的表達；同時還發(fā)現(xiàn)miRNA-224能通過靶向其3'-UTR直接降低1的水平，而之后的1敲除實驗顯示β-catenin的表達水平會顯著提高，這些結(jié)果表明miRNA-224對SSCs的增殖和分化具有重要調(diào)控作用且能夠通過Wnt/β-catenin 通路來促進精原細胞分化。王銀娟等發(fā)現(xiàn)miRNA-322在SSCs的表達量隨著SSCs的發(fā)育而降低，體外增殖實驗發(fā)現(xiàn)miRNA-322被抑制的SSCs中與分化有關(guān)的基因如8和等表達量上調(diào)，而SSCs本身的增殖能力受到抑制；當(dāng)使用氯化鋰處理SSCs后發(fā)現(xiàn)miRNA-322表達量被上調(diào)，同時Rassf8被下調(diào)，而miRNA-322的上調(diào)會導(dǎo)致Wnt通路中下游基因表達下調(diào)，之后用檢測細胞周期時發(fā)現(xiàn)miRNA-322的表達會使增加S期和G2/M期的比例，說明miRNA-322對SSCs的增殖和分化具有重要調(diào)控作用。

圖1 成年小鼠SSCs的調(diào)控[18]Fig.1 Regulation of adult mouse SSCs[18]

5 SSCs的應(yīng)用

SSCs作為雄性生殖干細胞能通過增殖、分化不斷產(chǎn)生精子，對SSCs的研究能對精子發(fā)生機理、治療雄性動物不育以及畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展方面都具有重要作用。Zarandi等研究表明在癌癥治療前，對癌癥患者的睪丸組織進行分離保存，等治愈后再將睪丸中的SSCs進行體外擴增并重新移植入患者體內(nèi)，可以有效保存癌癥患者的生育力。通過將優(yōu)良種畜的SSCs移植入經(jīng)濟價值較低的公畜睪丸中，能有效提高優(yōu)良品種的繁殖效率。此外SSCs還能通過去分化和轉(zhuǎn)分化的作用生產(chǎn)其他類型的細胞，目前已有研究證明SSCs能直接轉(zhuǎn)分化為功能性肝細胞。

6 小 結(jié)

隨著精原干細胞深入研究，人們對精子發(fā)生過程的研究取得了一定的進展，對小鼠等小型動物SSCs的體外培養(yǎng)體系已經(jīng)初步建立，但是對哺乳動物等大動物方面仍存在較多問題，如對SSCs分離純化時樣本獲取困難同時缺乏特異性分子標記使分離純化效率較低；對不同動物SSCs的分離純化技術(shù)不同，但都操作復(fù)雜，成本較高；對SSCs體外培養(yǎng)體系中維持其增殖以及干細胞特性所需物質(zhì)尚不明確，使SSCs難以在體外長期培養(yǎng)及傳代，給研究增加了難度；對SSCs誘導(dǎo)分化的機理不是很清楚，因此在后續(xù)研究中建立各種動物高效且簡便的SSCs分離、純化方法；進一步探索體外培養(yǎng)體系中所需具體物質(zhì)解決體外長期培養(yǎng)及傳代的穩(wěn)定性問題；探索SSCs體外誘導(dǎo)分化方法，為SSCs的移植提供材料，同時克服SSCs移植過程中免疫排斥問題，提高移植成功率將成為研究重點。