林 韜,李瑩華,連雅雯,陳曉偉,萬 芪

（1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 青島大學(xué)神經(jīng)再生與康復(fù)研究院，山東 青島 266071；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，吉林 長春 130021）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是因腦部供血動脈發(fā)生堵塞導(dǎo)致腦組織壞死的一種常見腦血管疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高和病死率高等特點，嚴(yán)重影響了人們的生命健康和生活質(zhì)量［1］。在超急性期及時再通血管和重建血流是缺血性腦卒中治療的主要手段。然而腦缺血區(qū)域的血流復(fù)流后可能會導(dǎo)致短時間內(nèi)神經(jīng)元受損加劇和功能障礙，即腦缺血再灌注損傷。因此，如何有效減少腦缺血再灌注造成的神經(jīng)元死亡，加速腦損傷后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的修復(fù)是目前國內(nèi)外研究的重點和難點。

生長激素是由腦垂體前葉嗜酸性顆粒細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，研究［2-4］顯示：生長激素作為一種多向性激素，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后大腦的神經(jīng)保護和修復(fù)有明顯的治療作用?；A(chǔ)研究［5-6］證實：重組人生長激素可改善局灶性腦缺血小鼠的認(rèn)知功能，其機制與增加血清及腦組織中的神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)，促進(jìn)梗死灶周圍區(qū)域和海馬的神經(jīng)修復(fù)有關(guān)，但運動功能改善方面的研究鮮有報道。一項臨床研究［7］顯示：重組人生長激素能夠提高IS患者的日常生活活動能力，降低肌肉疲勞度，抑制肌纖維數(shù)量的減少，因此認(rèn)為生長激素具有改善IS后運動功能障礙的潛力，但缺乏基礎(chǔ)理論依據(jù)。本研究通過給予腦缺血再灌注損傷模型小鼠生長激素干預(yù)，觀察其對小鼠運動功能的影響，并探討其可能機制，從分子生物學(xué)水平為生長激素在治療IS中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器8～10周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠，平均體質(zhì)量（23±2）g，購自吉林乾和模式生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）-2019-0001。小鼠飼養(yǎng)于恒溫（22℃～24℃）房間，自由飲食，遵循晝夜節(jié)律。突觸蛋白1（synapsin 1，SYN1）抗體和GADPH抗體購自美國Cell Signaling公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自英國Abcam公司，TTC購自美國Sigma公司，BCA蛋白定量試劑盒、高效RIPA裂解液和ECL發(fā)光液均購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）線栓購自瑞沃德生命科技有限公司，體視顯微鏡購自日本Olympus公司，電泳儀和電轉(zhuǎn)儀購自美國Bio-Rad公司，恒溫水浴鍋購自江蘇省榮化儀器制造公司。

1.2 實驗動物分組、處理和給藥方式小鼠在10%水合氯醛（350 mg·kg－1）腹腔麻醉下，采用改良Zea-Longa線栓法制作腦缺血再灌注損傷模型，隨機分為生長激素治療組（腦缺血再灌注+生長激素，SG組）和對照組（腦缺血再灌注+生理鹽水，SS組），每組12只。SG組小鼠于造模后48 h開始頸部皮下注射重組人生長激素［5，8］，劑量為1.4 mg·kg－1·d－1，持續(xù)14 d；SS組小鼠注射生理鹽水，注射時間、劑量、部位及次數(shù)與SG組小鼠一致。

1.3 腦缺血再灌注損傷模型制備小鼠在術(shù)前12 h禁食，術(shù)前4 h禁水。麻醉后，頸部備皮消毒，切開頸部正中皮膚，鈍性分離暴露左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，將線栓沿頸總動脈插至頸內(nèi)動脈，直至線栓頂端稍有阻力感（大腦中動脈開口處），固定線栓。1.5 h后，緩慢退出線栓，使頸內(nèi)動脈重新得到血流灌注。

1.4 TTC染色法驗證腦缺血再灌注損傷模型建立腦缺血再灌注24h后，通過TTC染色結(jié)果驗證模型是否制作成功。小鼠斷頭取腦，將腦組織迅速置于－20℃冰箱，20 min后取出，行冠狀切片，切為5片，厚度為2 mm。將切好的腦組織切片置入2%TTC染色液中，置于37℃水浴中避光孵育30 min，采用0.1 mol·L－1PBS溶液沖洗2～3次后拍照，保存圖片。正常組織染色為紅色，腦梗死組織為白色。

1.5 Longa法評價小鼠神經(jīng)功能缺損情況腦缺血再灌注24h后，采用Longa法［9］進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。Longa法評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，正常，無神經(jīng)功能缺損；1分，左側(cè)前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損；2分，行走時，大鼠向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分，行走時，大鼠身體向癱瘓側(cè)傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分，不能自發(fā)行走，有意識喪失。評分1～3分者為造模成功，評分為0或4分或小鼠死亡視為造模失敗。剔除造模失敗小鼠，及時補充備用小鼠。

1.6 平衡木實驗檢測小鼠運動協(xié)調(diào)能力參考文獻(xiàn)［10］的方法進(jìn)行平衡木實驗，用于評價腦缺血小鼠平衡功能及身體協(xié)調(diào)性。將100 cm×2 cm的橫梁平放于距地面50 cm處（支撐柱：1.5 cm×1.5 cm×50.0 cm），讓小鼠在其上行走。在起點處放置一盞燈（有60 W燈泡）進(jìn)行強光刺激，末端放置1個黑匣子（20 cm×20 cm×20 cm，有1個4 cm×5 cm的入口孔）作為終點。攝像機記錄小鼠在橫梁中間80 cm的行走過程。根據(jù)Feeney評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分：7分，能夠順利爬行橫梁，癱瘓肢體完全起作用，無明顯神經(jīng)體征；6分，能夠爬過橫梁，癱瘓肢體起作用＞50%；5分，能夠爬過橫梁，癱瘓肢體起作用＜50%；4分，不能順利爬過橫梁，跌倒概率＜50%；3分，不能順利爬過橫梁，跌倒概率＞50%；2分，在橫梁上不能行走，但可以坐在上面；1分，完全不能爬過橫梁且無法將后肢放在水平位置，放在橫梁上會掉下去。分別于損傷前、損傷后1 d和損傷后16 d進(jìn)行平衡木實驗，對小鼠行走過程中的表現(xiàn)進(jìn)行評分，得分越高表明小鼠運動協(xié)調(diào)能力越好。

1.7 網(wǎng)屏實驗檢測小鼠肢體肌力參考文獻(xiàn)［11］的方法進(jìn)行網(wǎng)屏實驗，用于評估腦缺血小鼠前后肢運動協(xié)調(diào)能力及肌力情況。網(wǎng)屏為50 cm×40 cm網(wǎng)帶，網(wǎng)眼1 cm×1 cm，在網(wǎng)屏下方鋪12 cm厚的海綿。先將網(wǎng)屏水平放置，而后將小鼠放置其上，啟動秒表，在2 s內(nèi)將此屏倒置，直至小鼠滑落，上限為60 s。分別于損傷前、損傷后1 d和損傷后16 d進(jìn)行網(wǎng)屏實驗，記錄小鼠在網(wǎng)屏上停留的時間，時間越短表明肢體功能損傷越嚴(yán)重。

1.8 圓筒實驗檢測小鼠患肢使用率參考文獻(xiàn)［12］的方法進(jìn)行圓筒實驗，檢測小鼠在貼壁站立過程中患側(cè)前肢的使用率。實驗時將小鼠置于透明圓筒中（高17.50 cm，內(nèi)徑8.80 cm，外徑9.50 cm，壁厚0.35 cm），觀察5 min內(nèi)小鼠前肢垂直探索筒壁過程，分別記錄左側(cè)（健側(cè)）、右側(cè)（偏癱側(cè)）和雙側(cè)觸及筒壁的次數(shù)。根據(jù)公式計算小鼠肢體的使用情況。偏側(cè)優(yōu)勢=（右側(cè)+0.5×雙側(cè)）/（左側(cè)+右側(cè)+雙側(cè)）。局灶性腦缺血后，小鼠前肢的使用情況具有不對稱性，損傷越重，越傾向于使用健側(cè)前肢。分別于損傷前、損傷后1 d和損傷后16 d進(jìn)行圓筒實驗，記錄小鼠患側(cè)前肢使用率，數(shù)值越低表明患側(cè)前肢損傷越嚴(yán)重。

1.9 免疫印跡法檢測小鼠梗死灶周圍區(qū)域中SYN1表達(dá)水平行為學(xué)實驗結(jié)束后，將小鼠麻醉，采用0.9%生理鹽水進(jìn)行快速在體心臟灌注，隨后斷頭取腦，分離梗死灶周圍組織，－80℃保存。采用RIPA裂解液（同時加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解組織，超聲震蕩樣品，4℃離心10 min，吸取上清備用。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測樣品蛋白濃度，計算上樣量。采用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下用3%BSA封閉1.5 h。加入一抗（SYN 1，1∶10 000；GAPDH，1∶5 000），4℃過夜。TBST洗膜5 min×3次，孵育HRP標(biāo)記的二抗（HRP-IgG，1∶5 000）1.5 h，TBST洗膜10 min×3次。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。采用Image J軟件分析2組樣品條帶的灰度值，計算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白的表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用GraphPad Prism 8軟件制圖。2組小鼠運動協(xié)調(diào)能力評分、倒置抓握網(wǎng)屏?xí)r的停留時間、患側(cè)肢體使用率和梗死灶周圍區(qū)域中SYN1表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，組內(nèi)損傷前后比較采用配對t檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠腦缺血再灌注模型建立建立腦缺血再灌注模型24 h后，采用Longa法評估小鼠神經(jīng)缺損程度，最終將評分為1～3分的小鼠納入研究。隨機選取6只Longa評分為1～3分的小鼠進(jìn)行TTC染色，結(jié)果顯示：缺血側(cè)腦組織呈現(xiàn)出大范圍梗死灶，表明小鼠腦缺血再灌注模型建立成功。見圖1。其余24只小鼠隨機分為SG組和SS組進(jìn)行下一步實驗，每組12只。

圖1 腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織形態(tài)表現(xiàn)（TTC）Fig.1 Morphology of brain tissue of mice with cerebral ischemia-reperfusion injury（TTC）

2.2 2組小鼠運動協(xié)調(diào)能力評分平衡木實驗結(jié)果顯示：與損傷前比較，損傷后1 d，2組小鼠運動協(xié)調(diào)能力評分明顯降低（P＜0.01），提示腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致小鼠運動協(xié)調(diào)能力受損；損傷后16 d，2組小鼠運動協(xié)調(diào)能力評分均高于損傷后1 d（P＜0.01），提示腦缺血再灌注損傷小鼠運動協(xié)調(diào)能力均有一定程度的恢復(fù)；SG組小鼠較SS組運動協(xié)調(diào)能力評分升高（P＜0.05），提示生長激素可以促進(jìn)腦缺血再灌注損傷小鼠運動協(xié)調(diào)能力的恢復(fù)。見圖2。

圖2 平衡木實驗檢測2組小鼠運動協(xié)調(diào)能力評分Fig.2 Scores of motor coordination abilities of mice in two groups detected by beam balance test

2.3 2組小鼠肌力網(wǎng)屏實驗結(jié)果顯示：與損傷前比較，2組小鼠在損傷1 d后倒置抓握網(wǎng)屏?xí)r的停留時間明顯縮短（P＜0.01），表明腦缺血再灌注損傷后，小鼠肌力出現(xiàn)明顯降低；損傷后16 d，2組小鼠倒置抓握網(wǎng)屏?xí)r的停留時間均長于損傷后1 d（P＜0.01），表明其肌力均有一定程度的改善；與SS組比較，SG組小鼠倒置抓握網(wǎng)屏?xí)r的停留時間明顯延長（P＜0.05），提示生長激素有利于促進(jìn)腦缺血再灌注損傷小鼠肌力恢復(fù)。見圖3。

圖3 網(wǎng)屏實驗檢測2組小鼠倒置抓握網(wǎng)屏?xí)r停留時間Fig.3 Residence time of grasping screen upside down of mice in two groups detected by screen test

2.4 2組小鼠患側(cè)肢體使用率圓筒實驗結(jié)果顯示：與損傷前比較，2組小鼠在損傷后1 d患側(cè)肢體使用率明顯降低（P＜0.01），表明腦缺血再灌注損傷后，小鼠表現(xiàn)出明顯的偏癱現(xiàn)象，即其爬壁過程中更加依賴于健側(cè)前肢；損傷后16 d，2組小鼠患側(cè)肢體使用率均有所升高，其中SG組小鼠較SS組患側(cè)肢體使用率更高（P＜0.05），提示生長激素能夠提高腦缺血再灌注損傷小鼠在爬壁過程中患側(cè)肢體使用次數(shù)。見圖4。

圖4 圓筒實驗檢測2組小鼠患側(cè)肢體使用率Fig.4 Utilization rates of affected limbs of mice in two groups detected by cylinder test

2.5 2組小鼠梗死灶周圍區(qū)域中SYN 1表達(dá)水平損傷后16 d，與SS組（0.58±0.02）比較，SG組小鼠梗死灶周圍區(qū)域中SYN1表達(dá)水平（0.73±0.05）明顯升高（P＜0.05），提示生長激素能夠促進(jìn)腦缺血再灌注損傷小鼠梗死灶周圍區(qū)域中SYN1表達(dá)。見圖5。

圖5 2組小鼠梗死灶周圍區(qū)域中SYN1表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of SYN 1 in peri-infarct region of mice in two groups

3 討 論

近年來生長激素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究和應(yīng)用日益受到人們的關(guān)注。生長激素廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的皮質(zhì)、海馬、殼核、丘腦和脈絡(luò)叢等部位［13］，一方面，生長激素通過作用于腦組織中的相應(yīng)受體，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號通路，對受損的腦組織起到神經(jīng)保護作用；另一方面，其通過提高內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化和增殖，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)與修復(fù)作用［14］。

劉海濤等［8］對腦缺血再灌注損傷大鼠模型進(jìn)行生長激素干預(yù)發(fā)現(xiàn)：大鼠損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯減少，巢蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明生長激素可以抑制細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。ONG等［6］通過光化學(xué)血栓閉塞誘導(dǎo)小鼠局灶性腦缺血48h后外周給予生長激素的研究結(jié)果顯示：生長激素可顯著改善小鼠認(rèn)知功能，其機制與促進(jìn)梗死灶周圍區(qū)域的神經(jīng)修復(fù)有關(guān)。

本研究采用線栓法制備可逆性MCAO模型，誘導(dǎo)小鼠腦缺血再灌注損傷后對側(cè)肢體運功功能障礙。該模型具有創(chuàng)傷小、缺血部位固定、可準(zhǔn)確控制缺血和再灌注時間及能夠高度模擬人類腦梗死的整個過程等優(yōu)點，是探討卒中后功能障礙改善機制的理想模型［15］。

研究［16］顯示：腦卒中后因中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損，低級中樞失去高級中樞控制，常導(dǎo)致機體出現(xiàn)肌肉痙攣、運動協(xié)調(diào)能力下降和平衡功能喪失等，嚴(yán)重影響肢體的正常運動。本研究通過平衡木實驗觀察腦缺血再灌注損傷小鼠運動協(xié)調(diào)能力變化的結(jié)果顯示：腦缺血再灌注損傷后1 d，小鼠運動協(xié)調(diào)能力評分明顯降低，表明腦缺血再灌注損傷造成了小鼠運動協(xié)調(diào)能力降低。為觀察生長激素是否可以改善小鼠的運動協(xié)調(diào)能力，對2組小鼠分別進(jìn)行生長激素和生理鹽水干預(yù)的結(jié)果顯示：2組小鼠運動協(xié)調(diào)能力評分均有不同程度的提高，表明缺血再灌注損傷后大腦有一定程度的自然恢復(fù)，其可能機制與病灶周圍水腫消退、側(cè)支循環(huán)形成和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放等有關(guān)［17］。此外，與SS組比較，SG組小鼠運動協(xié)調(diào)能力評分升高更為明顯，表明重組人生長激素可以促進(jìn)腦缺血再灌注損傷小鼠運動協(xié)調(diào)能力的恢復(fù)。

本研究采用網(wǎng)屏實驗評估腦缺血再灌注損傷小鼠前后肢肌力情況的結(jié)果顯示：腦缺血再灌注損傷后1 d，小鼠倒置抓握網(wǎng)屏?xí)r的停留時間均明顯縮短，提示腦卒中后小鼠肌力明顯下降，運動功能嚴(yán)重?fù)p傷。經(jīng)生長激素或生理鹽水干預(yù)后，2組小鼠肌力均有一定程度的自然恢復(fù)。與SS組比較，SG組小鼠支撐于網(wǎng)屏的時間延長程度更高，表明重組人生長激素能夠促進(jìn)腦缺血再灌注損傷小鼠肌力恢復(fù)，進(jìn)而改善運動功能。研究［18］顯示：注射重組人生長激素4周后，大鼠骨骼肌肌纖維橫截面積明顯增加，肌肉總蛋白含量增加。本文作者認(rèn)為：本研究中SG組小鼠肌力的改善可能與重組人生長激素影響骨骼肌形態(tài)及代謝機能有關(guān)。

局灶性腦缺血后，小鼠前肢的使用情況具有不對稱性，損傷越重，越傾向于使用健側(cè)前肢。本研究通過圓筒實驗評估小鼠患側(cè)前肢使用率的結(jié)果顯示：損傷后1 d，小鼠患側(cè)肢體使用率均明顯降低，提示腦缺血再灌注損傷后小鼠出現(xiàn)明顯的偏癱現(xiàn)象，爬壁過程中更依賴于健側(cè)前肢。損傷后2 d分別對小鼠進(jìn)行14 d生長激素和生理鹽水干預(yù)的結(jié)果顯示：與SS組比較，SG組小鼠患側(cè)肢體使用率明顯升高，表明重組人生長激素有利于腦缺血再灌注損傷小鼠偏癱肢體運動功能的恢復(fù)。HEREDIA等［19］通過糖丸抓取實驗評估重組人生長激素對單側(cè)額葉皮質(zhì)損傷大鼠運動功能的影響，發(fā)現(xiàn)治療結(jié)束后大鼠患側(cè)肢體使用率明顯升高，與本研究結(jié)果一致。

大鼠腦皮質(zhì)缺血模型中，行為學(xué)的改善與SYN1免疫陽性物質(zhì)的表達(dá)升高顯著相關(guān)［20］。SYN1是一種鈣結(jié)合糖蛋白，特異性地位于軸突終末的突觸前囊泡膜上，與突觸的形成、成熟和可塑性密不可分［21-22］。研究［23-25］顯示：IS的發(fā)病與修復(fù)過程中，存活的神經(jīng)元可通過軸突出芽形成不同的分支，與原有的突觸后位點或新的突觸后位點發(fā)生接觸構(gòu)成新的突觸，同時激活處于休眠狀態(tài)的側(cè)支和突觸聯(lián)系，從而完成神經(jīng)回路改造與突觸重塑。而腦損傷后運動功能障礙恢復(fù)的關(guān)鍵在于受損區(qū)域的皮質(zhì)重建和神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，這與突觸重塑的發(fā)生密切相關(guān)［26-27］。本研究采用免疫印跡法檢測SYN1表達(dá)水平的結(jié)果顯示：治療結(jié)束后，與SS組比較，SG組小鼠梗死灶周圍區(qū)域中SYN1表達(dá)水平明顯升高，提示生長激素能夠促進(jìn)腦缺血再灌注損傷小鼠梗死灶周圍區(qū)域中SYN1表達(dá)。SANCHEZ-BEZANILLA等［5］發(fā)現(xiàn)：重組人生長激素治療能夠促進(jìn)腦缺血大鼠梗死灶周圍區(qū)域中AMPA受體亞單位GluR1蛋白的表達(dá)，提高梗死灶周圍區(qū)域突觸可塑性。本研究進(jìn)一步證實了生長激素在促進(jìn)IS后突觸可塑性中的重要作用。本文作者推測：生長激素改善IS小鼠運動功能的機制之一是提高突觸的可塑性，即生長激素可能是通過增強SYN1的表達(dá)，促進(jìn)腦組織軸突再生和突觸重構(gòu)，進(jìn)而對受損的運動傳導(dǎo)通路起修補作用，加速運動功能的恢復(fù)。

綜上所述，腦缺血再灌注損傷會導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)運動功能障礙，外周注射重組人生長激素可以改善小鼠受損的運動功能，其機制可能與促進(jìn)梗死灶周圍區(qū)域中SYN1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生并增強突觸可塑性有關(guān)。重組生長激素在局灶性腦缺血再灌注小鼠運動功能的作用機制尚需進(jìn)一步研究。