侯曉鈺,李 婭,謝江燕,宋宜安,張 潔,胥建輝

（1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，四川 成都 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院 體溫與炎癥四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610500）

冷防御反應(yīng)是恒溫動(dòng)物暴露于冷環(huán)境中時(shí)啟動(dòng)的前饋體溫調(diào)節(jié)活動(dòng)，其可在環(huán)境冷刺激引起體核溫度變化前促使機(jī)體產(chǎn)熱增加，散熱減少，以維持體核溫度相對(duì)穩(wěn)定［1-3］。因此冷防御反應(yīng)是恒溫動(dòng)物面臨環(huán)境溫度挑戰(zhàn)時(shí)的關(guān)鍵體溫調(diào)節(jié)活動(dòng)，具有重要的生理意義［1-3］。妊娠期母體的多個(gè)系統(tǒng)和器官會(huì)發(fā)生一系列生理變化，其中也包括體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)［4-5］。已有研究［6-7］表明：多種哺乳動(dòng)物的基礎(chǔ)體溫和熱中性溫度區(qū)在妊娠晚期時(shí)明顯下移；此外，多種刺激源（如應(yīng)激和感染等）引起的體溫調(diào)節(jié)活動(dòng)在大鼠妊娠晚期時(shí)也受到了明顯的抑制［8］。然而，在大鼠妊娠期冷防御反應(yīng)是否具有適應(yīng)性的改變尚不清楚。

肩胛間區(qū)棕色脂肪組織（interscapular brown adipose tissue，iBAT）是參與冷防御反應(yīng)的重要產(chǎn)熱效應(yīng)器［9-10］。機(jī)體皮膚受到冷刺激時(shí)，iBAT的產(chǎn)熱情況（即冷防御性iBAT產(chǎn)熱）直接反映了冷防御響應(yīng)的 強(qiáng) 度［1，9］。研究［11］顯示：長(zhǎng)時(shí)間 處 于冷環(huán)境中的妊娠晚期大鼠體溫下降幅度明顯高于非妊娠期雌性大鼠，提示妊娠晚期大鼠對(duì)冷的耐受能力下降。本文作者推測(cè)妊娠期大鼠的冷防御反應(yīng)可能受到抑制，但目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究采用腹部皮膚冷刺激的方法建立冷防御反應(yīng)模型，通過(guò)監(jiān)測(cè)非妊娠期、妊娠中期和妊娠晚期雌性大鼠皮膚受到冷刺激時(shí)iBAT的產(chǎn)熱情況及支配iBAT的交感神經(jīng)放電活動(dòng)（sympathetic nerve activity，SNA），觀察妊娠對(duì)雌性大鼠冷防御反應(yīng)的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑和儀器42只成年SD雌性大鼠和28只雄性大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2020-030。氨基甲酸乙酯、α-氯醛糖、液體石蠟和體積分?jǐn)?shù)為75%酒精（四川省成都市科龍化工試劑廠）。多通道溫度信號(hào)測(cè)量系統(tǒng)（JK808）和K型熱電偶（常州金艾聯(lián)電子科技有限公司），生物信號(hào)采集系統(tǒng)（BF420S）和鼠恒溫試驗(yàn)臺(tái)（JR30）（成都泰盟軟件有限公司），紅外線加熱器（CQ-61P）（重慶航天火箭電子技術(shù)有限公司），冷光源（QAXK-TY）（千奧星科南京生物科技有限公司）。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組和處理所有大鼠均自由飲食和進(jìn)水，飼養(yǎng)溫度（25±1）℃，明暗時(shí)間各12 h（晝光期為06：00～18：00）。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將雌性大鼠隨機(jī)分為非妊娠期、妊娠中期和妊娠晚期組，每組各14只。非妊娠期組雌性大鼠不與雄性大鼠合籠。采用陰道涂片法檢測(cè)妊娠中期和妊娠晚期組雌性大鼠動(dòng)情周期，在動(dòng)情期前一天將雌鼠和雄鼠合籠交配，次日上午檢查，以發(fā)現(xiàn)陰道栓視為交配成功，交配當(dāng)天為妊娠第0天，此后分別單獨(dú)飼養(yǎng)交配成功雌性大鼠至妊娠第15和20天。

1.3 各組大鼠皮膚、直腸和iBAT溫度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)當(dāng)日上午9時(shí)，腹腔注射17%氨基甲酸乙酯和1%α-氯醛糖混合液（5 mL·kg－1）麻醉各組大鼠，室溫設(shè)置為25℃，采用恒溫?zé)岚搴图t外加熱燈將大鼠體核溫度維持在約37℃，剔除大鼠腹部鼠毛，將水袋置于腹下，以備冰水注入。此后，剔除大鼠背部肩胛間區(qū)鼠毛，75%酒精消毒后沿肩胛間區(qū)正中線切開(kāi)1個(gè)1.5～2.0 cm切口，暴露iBAT（圖1A），將多通道溫度信號(hào)采集系統(tǒng)的溫度探頭插入右側(cè)iBAT中（iBAT沿大鼠背部肩胛間區(qū)中線對(duì)稱分布，分為左右兩葉），采用縫合線將溫度探頭固定于背部肌肉上。其余溫度探頭直接插入直腸中或采用紙膠布固定于大鼠腹部，以同步測(cè)量iBAT、直腸和腹部皮膚溫度。

將記錄的溫度信號(hào)導(dǎo)入JK80X數(shù)據(jù)分析軟件，通過(guò)該軟件分析各組大鼠皮膚、iBAT和直腸溫度。計(jì)算各組大鼠皮膚冷刺激前30 s溫度的平均值，作為基礎(chǔ)值；計(jì)算各組大鼠皮膚冷刺激時(shí)持續(xù)30 s的最高（或最低）溫度平均值，作為冷刺激時(shí)的響應(yīng)值。接受冷刺激后，各組大鼠iBAT、直腸和皮膚溫度的變化幅度值（上升幅度或降低幅度）=接受冷刺激時(shí)溫度平均值－接受冷刺激前溫度平均值。

1.4 各組大鼠皮膚、直腸溫度和iBAT SNA情況檢測(cè)實(shí)驗(yàn)當(dāng)日上午9時(shí)，腹腔注射17%氨基甲酸乙酯和1%α-氯醛糖混合液（5 mL·kg－1）麻醉大鼠，室溫設(shè)置為25℃，采用恒溫?zé)岚搴图t外加熱燈將大鼠體核溫度維持在約37℃，剔除大鼠腹部鼠毛，將水袋置于腹部下，以備冰水注入。此后，剪開(kāi)氣管行氣管插管術(shù)，75%酒精消毒后沿肩胛間區(qū)正中線切開(kāi)1個(gè)1.5～2.0 cm切口。止血鉗鈍性分離iBAT，暴露位于肩胛骨下的交感神經(jīng)節(jié)后纖維，玻璃分針?lè)蛛x支配右側(cè)iBAT的交感神經(jīng)（圖1B），剪斷神經(jīng)外周端，掛于引導(dǎo)電極上，滴加液體石蠟保持神經(jīng)濕潤(rùn)，將引導(dǎo)電極與生物信號(hào)采集系統(tǒng)相連，記錄iBAT SNA（單位為μV）。同時(shí)采用多通道溫度信號(hào)采集系統(tǒng)同步監(jiān)測(cè)各組大鼠直腸和腹部皮膚溫度。

圖1 雌性大鼠的iBAT和支配iBAT的交感神經(jīng)纖維形態(tài)表現(xiàn)Fig.1 Morphology of iBAT and sympathetic nerve innervating iBAT of female rats

將記錄的交感神經(jīng)放電信號(hào)導(dǎo)入Spike2數(shù)據(jù)分析軟件，通過(guò)該軟件分析交感神經(jīng)放電幅度值。計(jì)算皮膚冷刺激前30 s的放電幅度平均值，作為交感神經(jīng)放電基礎(chǔ)值；計(jì)算皮膚冷刺激時(shí)持續(xù)30 s的最大放電幅度平均值，作為冷刺激時(shí)交感神經(jīng)放電響應(yīng)值。接受冷刺激后，iBAT SNA變化幅度值（上升幅度或降低幅度）=接受冷刺激后iBAT SNA平均值－接受冷刺激前iBAT SNA平均值。

1.5 大鼠腹部皮膚冷刺激方案大鼠直腸溫度穩(wěn)定后，向水袋中注入4℃冰水（冰箱中預(yù)冷），150 s后抽出冰水，降低大鼠腹部皮膚溫度約10℃，同時(shí)采用多通道體溫和生物信號(hào)采集系統(tǒng)監(jiān)測(cè)大鼠體溫和交感神經(jīng)放電變化情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠皮膚溫度、直腸溫度、iBAT溫度和iBAT SNA以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way AVOVA），組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNKq檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠皮膚、直腸和iBAT溫度與冷刺激前比較，接受冷刺激后，各組大鼠腹部皮膚溫度均降低（P＜0.05）；與冷刺激前比較，接受冷刺激后，各組大鼠的直腸溫度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＞0.05）。與冷刺激前比較，接受冷刺激后，非妊娠期和妊娠中期組雌性大鼠iBAT溫度明顯升高（P＜0.05），妊娠晚期組大鼠iBAT溫度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，接受冷刺激后，各組大鼠皮膚溫度的降低幅度組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組大鼠直腸溫度的變化幅度組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。接受冷刺激后，非妊娠期組大鼠和妊娠中期組大鼠iBAT溫度的上升幅度組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。接受冷刺激后，與非妊娠期組或妊娠中期組大鼠比較，妊娠晚期組大鼠iBAT溫度的上升幅度明顯減?。≒＜0.05）。見(jiàn)圖2和表1。

表1 皮膚冷刺激前后各組大鼠皮膚、直腸和iBAT溫度Tab.1 Temperature of skin and rectum,and iBAT of rats in various groups before and after skin cooling（n=7，x±s，θ/℃）

圖2 各組大鼠皮膚受到冷刺激后皮膚、直腸和iBAT溫度曲線Fig.2 Temperature curves of skin,rectum and iBAT of rats in various groups after skin cooling

2.2 各組大鼠皮膚和直腸溫度及iBAT SNA與冷刺激前比較，接受冷刺激后，各組大鼠腹部皮膚溫度均明顯降低（P＜0.05），直腸溫度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與冷刺激前比較，接受冷刺激后，非妊娠期組和妊娠中期組雌性大鼠iBAT SNA明顯增加（P＜0.05）；妊娠晚期組大鼠的iBAT SNA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，接受冷刺激后，各組大鼠皮膚溫度降低幅度組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組大鼠直腸溫度改變幅度組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。接受冷刺激后，非妊娠期組和妊娠中期組雌性大鼠iBAT SNA上升幅度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。接受冷刺激后，與非妊娠期組或妊娠中期組比較，妊娠晚期組大鼠iBAT SNA上升幅度明顯減?。≒＜0.05）。見(jiàn)表2和圖3。

圖3 各組大鼠皮膚受到冷刺激后皮膚和直腸溫度及iBAT SNAFig.3 Skin and rectum temperature and iBAT SNA of rats in various groups after skin cooling

表2 皮膚冷刺激前后各組大鼠皮膚溫度、iBAT SNA和直腸溫度Tab.2 Temperature of skin,iBAT SNA，and temperature of rectum of rats in various groups before and after skin cooling(n=7,x±s）

3 討 論

冷防御反應(yīng)主要包括環(huán)境冷刺激引起的棕色脂肪和骨骼肌顫栗產(chǎn)熱及血管收縮保熱［1］。iBAT產(chǎn)熱是冷防御反應(yīng)的重要熱量來(lái)源之一，學(xué)者們［1-12］常通過(guò)監(jiān)測(cè)皮膚受到冷刺激時(shí)機(jī)體iBAT的溫度變化來(lái)評(píng)估冷防御反應(yīng)的情況。本研究采用冰水刺激大鼠腹部皮膚的同時(shí)監(jiān)測(cè)腹部皮膚溫度變化的結(jié)果顯示：各組大鼠皮膚溫度下降幅度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明給予了各組大鼠相同程度的冷刺激。本研究結(jié)果顯示：與接受冷刺激前比較，受到冷刺激時(shí)，非妊娠期和妊娠中期大鼠的直腸溫度無(wú)明顯改變，iBAT溫度明顯升高；且這2組大鼠iBAT的升溫幅度相似。上述結(jié)果與國(guó)外學(xué)者［1］在雄性大鼠上的發(fā)現(xiàn)是相似的，說(shuō)明皮膚冷刺激而非體核溫度改變導(dǎo)致了非妊娠期和妊娠中期雌性大鼠的iBAT產(chǎn)熱增加；提示妊娠中期和非妊娠期雌性大鼠與雄性大鼠一樣具有正常的冷防御反應(yīng)。本文作者發(fā)現(xiàn)：與接受冷刺激前比較，受到冷刺激時(shí)，妊娠晚期大鼠的直腸溫度無(wú)明顯改變，iBAT溫度無(wú)明顯變化；與非妊娠期和妊娠中期雌性大鼠比較，妊娠晚期大鼠受到冷刺激時(shí)的iBAT溫度上升幅度明顯減小，說(shuō)明皮膚冷刺激無(wú)法引起妊娠晚期大鼠iBAT產(chǎn)熱增加，同時(shí)還提示妊娠晚期大鼠的冷防御反應(yīng)受到明顯抑制。與本研究結(jié)果一致，國(guó)外學(xué)者［11］發(fā)現(xiàn)長(zhǎng) 時(shí) 間（30～60 min）暴 露 于0℃或10℃冷環(huán)境中的妊娠晚期大鼠體核溫度明顯低于處于同樣環(huán)境中的非妊娠期雌性大鼠。

近年冷防御反應(yīng)的機(jī)制逐漸被揭露：皮膚溫度感受器接收到的冷信號(hào)經(jīng)脊髓逐級(jí)上傳至體溫調(diào)節(jié)中樞，引起產(chǎn)熱神經(jīng)元興奮，參與產(chǎn)熱的下行神經(jīng)通路被激活，進(jìn)而導(dǎo)致交感節(jié)前神經(jīng)元興奮，支配iBAT的交感神經(jīng)放電增強(qiáng)，iBAT產(chǎn)熱增加［3，12-14］。為了進(jìn)一步探討妊娠期大鼠冷防御反應(yīng)改變是否與來(lái)自中樞的體溫調(diào)節(jié)信號(hào)受到影響有關(guān)，本文作者對(duì)比觀察了非妊娠期、妊娠中期和妊娠晚期大鼠的冷防御性交感神經(jīng)放電活動(dòng)。本研究結(jié)果顯示：與接受冷刺激前比較，受到冷刺激時(shí)非妊娠期和妊娠中期雌性大鼠的直腸溫度無(wú)明顯改變，iBAT SNA增強(qiáng)，說(shuō)明皮膚冷刺激而非體核溫度改變導(dǎo)致了非妊娠期和妊娠中期雌性大鼠的iBAT SNA增強(qiáng)。此外，受到冷刺激時(shí)，非妊娠期和妊娠中期雌性大鼠iBAT SNA的增幅相似，且這2種大鼠iBAT SNA的變化和iBAT溫度的變化一致；提示妊娠中期和非妊娠期雌性大鼠具有正常的冷防御反應(yīng)，與2種大鼠冷防御性iBAT SNA未受到明顯影響有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：與接受冷刺激前比較，接受冷刺激后妊娠晚期大鼠直腸溫度無(wú)明顯改變，iBAT SNA無(wú)明顯變化；此外，與非妊娠期組和妊娠中期組比較，妊娠晚期組大鼠接受冷刺激后iBAT SNA上升幅度明顯減?。磺胰焉锿砥诮M大鼠接受冷刺激后iBAT SNA的變化與iBAT溫度的變化一致，提示妊娠晚期大鼠冷防御反應(yīng)減弱與該期大鼠的冷防御性iBAT SNA受到明顯抑制有關(guān)。

既往研究［15］表明：致熱介質(zhì)前列腺素E2引起的交感神經(jīng)放電和棕色脂肪產(chǎn)熱在大鼠妊娠晚期時(shí)同樣明顯減弱，提示來(lái)自中樞的促產(chǎn)熱體溫調(diào)節(jié)信號(hào)均受到抑制。國(guó)外學(xué)者［8］發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象可能與妊娠晚期大鼠下丘腦一氧化氮合成酶的表達(dá)增加有關(guān)。因?yàn)橐谎趸赏ㄟ^(guò)抑制體溫調(diào)節(jié)中樞（下丘腦視前區(qū)）神經(jīng)元的放電活動(dòng)降低體溫或抑制發(fā)熱；且腦室內(nèi)注射一氧化氮合成酶抑制劑可以恢復(fù)妊娠晚期大鼠的發(fā)熱反應(yīng)［16-17］。上述研究提示妊娠晚期大鼠冷防御反應(yīng)減弱可能與一氧化氮釋放引起促產(chǎn)熱的神經(jīng)通路抑制有關(guān)。該假設(shè)還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

iBAT產(chǎn)熱除了接受體溫調(diào)節(jié)中樞的調(diào)控，還受到其自身產(chǎn)熱能力的影響［9］。近年已有研究［18-19］顯示：與非妊娠期雌性大鼠比較，妊娠中期和晚期大鼠（或小鼠）iBAT內(nèi)解耦連蛋白1均表現(xiàn)出相似程度的降低；此外，這兩種大鼠iBAT的棕色脂肪細(xì)胞向白色或米色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，表明妊娠中晚期大鼠（或小鼠）iBAT的產(chǎn)熱能力降低。據(jù)此推測(cè)：如果妊娠中晚期大鼠iBAT產(chǎn)熱能力的改變?cè)谶@些大鼠的冷防御反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用，妊娠中期和晚期大鼠受到冷刺激時(shí)的iBAT產(chǎn)熱均明顯降低。但與此推論不一致的是，本研究結(jié)果顯示：妊娠中期大鼠受到冷刺激時(shí)的iBAT產(chǎn)熱并無(wú)明顯降低。上述研究結(jié)果提示：妊娠中晚期大鼠的產(chǎn)熱能力改變可能并非妊娠晚期大鼠受到冷刺激時(shí)產(chǎn)熱能力減弱的主要原因，其在妊娠期大鼠冷防御反應(yīng)的適應(yīng)性改變中可能未發(fā)揮不可或缺的作用。

為了滿足胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的需求，妊娠期母體會(huì)發(fā)生一系列適應(yīng)性改變，以儲(chǔ)存能量和減少消耗［19-20］。與此相反，正常的冷防御反應(yīng)卻會(huì)引起交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)，棕色脂肪產(chǎn)熱增加，機(jī)體的能量消耗上升［9］。研究［21-22］顯示：妊娠期母體的棕色脂肪組織產(chǎn)熱對(duì)胎盤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、胎兒生長(zhǎng)和子代的葡萄糖耐受性具有負(fù)面的影響。國(guó)外學(xué)者［9，23］發(fā)現(xiàn)：冷防御反應(yīng)在處于極度的低溫環(huán)境和食物缺乏等特殊情況下也會(huì)適應(yīng)性的減弱。因此，妊娠晚期大鼠冷防御反應(yīng)減弱可能是一種適應(yīng)性改變，其有助于母體保存能量，維持胎兒正常生長(zhǎng)發(fā)育。

綜上所述，非妊娠期和妊娠中期大鼠具有正常的冷防御反應(yīng)；妊娠晚期大鼠的冷防御反應(yīng)減弱。這種現(xiàn)象與妊娠晚期時(shí)冷防御性交感神經(jīng)放電活動(dòng)受到抑制有關(guān)。本研究結(jié)果有助于更深入地認(rèn)識(shí)妊娠期母體體溫調(diào)節(jié)活動(dòng)的適應(yīng)性改變及其機(jī)制。