劉曉華,房冰瑩,韓 曼,喬海法,于遠望

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)生理學(xué)教研室，陜西 咸陽 712046；2.陜西省針藥結(jié)合重點實驗室，陜西 咸陽 712046）

神經(jīng)病理痛是外周感覺神經(jīng)因損傷或疾病引起的疼痛。現(xiàn)有鎮(zhèn)痛藥對神經(jīng)病理痛的鎮(zhèn)痛效果欠佳，且常伴有嚴重的不良反應(yīng)［1］。明確神經(jīng)病理痛的發(fā)病機制，探尋新的分子靶點，進而研發(fā)新的鎮(zhèn)痛藥物是目前急需攻克的臨床難題。黃芩素是從中藥黃芩中提取的一種黃酮類有效成分。近年來黃岑素的抗炎和抗氧化等功能不斷得到證實［2］。黃芩素對炎癥痛的鎮(zhèn)痛作用明顯［3］，研究［4］顯示：黃芩素還可明顯減輕大鼠坐骨神經(jīng)損傷后的痛行為，但其機制尚不清楚。

近年來膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cellderived neurotropic factor，GDNF）在疼痛研究領(lǐng)域備受關(guān)注，GDNF可從不同環(huán)節(jié)調(diào)控痛覺信息的傳遞［5］。GDNF在不同神經(jīng)病理痛動物模型中均表現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛作用［6］。研究［7］顯示：磷酸化轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（phosphorylated transcription factor cAMP response element binding protein，p-CREB）可促進多巴胺能神經(jīng)元中GDNF基因的轉(zhuǎn)錄，使GDNF合成增加。有研究［8-9］顯示：黃芩素可通過p-CREB通路發(fā)揮對多巴胺能神經(jīng)的保護作用，但黃芩素對神經(jīng)病理痛的鎮(zhèn)痛作用是否與GDNF有關(guān)聯(lián)目前尚不清楚。本研究以大鼠慢性縮窄性神經(jīng)損傷（chronic constriction injury，CCI）為神經(jīng)病理痛模型，探討黃芩素對神經(jīng)病理痛的鎮(zhèn)痛作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器實驗選用健康、雄性SD大鼠48只，平均體質(zhì)量250 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2018-030。黃芩素購自美國Sigma公司，兔抗鼠c-Fos一抗（B7963）、兔抗鼠GDNF一抗（AB244211）和熒光二抗驢抗兔IgG（Alexa Fluor488）均購自美國Abcam公司。von Frey纖毛機械刺激針購自美國IITC公司，熱刺激儀購自美國LifeScience公司，冰凍切片機購自德國Leitz公司，生物顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 動物分組和CCI模型建立將48只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和黃芩素組，每組16只。各組大鼠腹腔注射5%水合氯醛（7 mL·kg－1）麻醉后，暴露游離一側(cè)坐骨神經(jīng)干，采用4-0絲線間隔1 mm結(jié)扎4次，逐層縫合組織。假手術(shù)組大鼠暴露坐骨神經(jīng)后不做結(jié)扎。手術(shù)后1 d，通過痛行為測定確定造模是否成功。造模成功后黃芩素組開始腹腔注射黃芩素20 mg·kg－1，連續(xù)注射7 d。

1.3 各組大鼠痛行為測定各組大鼠手術(shù)前測定基礎(chǔ)痛閾值，術(shù)后1 d開始，每隔3 d測量1次，持續(xù)28 d。大鼠患側(cè)機械縮足反射閾值（mechenaical withdral threshold，MWT）測定：up-down法推算大鼠的機械縮爪閾值。測定前大鼠置于有機玻璃箱內(nèi)適應(yīng)30 min后，采用von Frey纖毛絲刺激大鼠后肢足底中部，持續(xù)時間≤4 s，大鼠出現(xiàn)縮足或舔足行為視為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。測定從2 g纖毛刺激開始，當該力度不能引起陽性反應(yīng)時，給予相鄰大一級力度刺激；如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級力度刺激。如此連續(xù)進行，直至出現(xiàn)第一次陽性和陰性反應(yīng)差異，重復(fù)測定5次。最大力度為15 g，大于此值時記為15 g，每次刺激間隔30 s。

大鼠患側(cè)足底熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）測定：MWT測定完成后，將大鼠置于有機玻璃盒中適應(yīng)20 min后開始測定TWL。熱刺激儀照射動物患側(cè)足底，記錄縮足逃避反應(yīng)的時間作為熱刺激潛伏期。每只大鼠重復(fù)測量3次，每次間隔5 min，取3次平均值。如超過20 s大鼠仍無縮足或抬腿反應(yīng)則停止照射，以免引起實驗動物照射部位組織灼傷。

1.4 免疫熒光染色檢測各組大鼠脊髓背角組織中c-Fos陽性細胞數(shù)和背根神經(jīng)節(jié)（dosal root ganglion，DRG）中GDNF熒光強度實驗第11天，分別從各組取6只大鼠，采用免疫熒光染色測定各組大鼠脊髓背角組織中c-Fos陽性細胞數(shù)。其余大鼠在第28天行為學(xué)檢測完畢后，檢測DRG中GDNF熒光強度。給予大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定。取患側(cè)L 2和L 3 DRG或相應(yīng)脊髓節(jié)段置于4%多聚甲醛后固定12 h后轉(zhuǎn)移至30%蔗糖中脫水，制備冰凍切片（25μm），每只大鼠取5張切片，一抗（GDNF 1∶200，c-Fos 1∶200）4℃過夜。熒光二抗驢抗兔IgG室溫下孵育1 h后，PBST漂洗，裱片。陰性對照除一抗為抗體封閉液外，其余操作均相同。Olympus顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。根據(jù)文獻［10］對c-Fos表達采用Image J圖像軟件進行計數(shù)，對GDNF表達采用Image J圖像軟件進行熒光強度分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組大鼠MWT、TWL和脊髓背角組織中c-Fos陽性細胞數(shù)及GDNF熒光強度均以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNKq檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠MWT各組大鼠基礎(chǔ)MWT比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與術(shù)前比較，手術(shù)后1 d，模型組和黃芩素組大鼠MWT降低（P＜0.05）；手術(shù)前后假手術(shù)組大鼠MWT比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。后續(xù)不同時間點檢測結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠MWT均降低（P＜0.05），維持在低閾值水平；黃芩素組大鼠MWT在給藥第3天開始升高，后續(xù)時間點均維持在較高水平，與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠MWTFig.1 MWT of rats in various groups

2.2 各組大鼠TWL各組大鼠基礎(chǔ)TWL比較差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與手術(shù)前比較，手術(shù)后1 d，模型組和黃芩素組大鼠TWL明顯降低（P＜0.05）；手術(shù)前后假手術(shù)組大鼠TWL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。后續(xù)不同時間點檢測結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TWT均降低（P＜0.05）；黃芩素組大鼠TWL在給藥第3天開始升高，后續(xù)時間點均維持在較高水平；與模型組比較，黃芩素組大鼠術(shù)后各時間點TWL均升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠TWLFig.2 TWL of rats in various groups

2.3 各組大鼠脊髓背角組織中c-Fos陽性細胞數(shù)C-Fos蛋白為即刻早期表達蛋白，可以反映神經(jīng)元的激活狀態(tài)。各組大鼠實驗第11天采用免疫熒光法檢測脊髓背角組織中c-Fos表達的結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠脊髓背角組織中c-Fos陽性細胞數(shù)為（12±5）個，模型組大鼠脊髓背角組織中c-Fos陽性細胞數(shù)為（198±90）個。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓背角組織中c-Fos陽性細胞數(shù)明顯升高（P＜0.05）。黃芩素組大鼠c-Fos陽性細胞數(shù)為（68±48）個，較模型組明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠脊髓背角組織中c-Fos的表達（免疫熒光，Bar=100μm）Fig.3 Expressions of c-Fos in spinal dorsal horn tissue of ratsin variousgroups（Immunofluorescence,Bar=100μm）

2.4 各組大鼠DRG中GDNF熒光強度DRG是傳遞痛覺的一級神經(jīng)元所在的部位。假手術(shù)組大鼠DRG中GDNF熒光強度為80±69，模型組大鼠DRG中GDNF熒光強度為55±41；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠DRG中GDNF熒光強度明顯降低（P＜0.05）。黃芩素組大鼠DRG中GDNF熒光強度為82±71，較模型組明顯升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠DRG中GDNF熒光強度（免疫熒光，Bar=100μm）Fig.4 Fluorescenceintensitiesof GDNF in DRG of ratsin variousgroups(Immunofluorescence,Bar=100μm)

3 討 論

本研究采用大鼠CCI神經(jīng)病理痛模型，利用行為學(xué)和免疫熒光化學(xué)方法研究黃芩素對神經(jīng)病理痛的鎮(zhèn)痛作用及其機制。本研究結(jié)果顯示：黃芩素可明顯提高CCI模型大鼠機械痛閾值和熱痛閾值，抑制CCI模型大鼠脊髓背角組織中c-Fos蛋白的表達，并可翻轉(zhuǎn)CCI大鼠DRG中GDNF的表達。上述結(jié)果提示：黃芩素素對神經(jīng)病理的鎮(zhèn)痛作用可能與其促進GDNF的表達有關(guān)。

以往有關(guān)黃芩素鎮(zhèn)痛作用的研究［3-4］主要關(guān)注炎癥性疼痛和癌癥痛等疼痛。有關(guān)黃芩素對外周神經(jīng)壓迫引起的神經(jīng)病理痛的作用目前尚未見相關(guān)研究報道。本研究結(jié)果顯示：黃芩素對大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫引起的機械痛敏和熱痛敏行為有明顯的緩解作用。脊髓背角是痛覺信息傳遞的第2級神經(jīng)元所在的部位。c-Fos蛋白為即刻早期蛋白，當神經(jīng)元興奮時，其表達水平迅速升高，常被當作神經(jīng)元激活標志物。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠脊髓背角組織中c-Fos陽性細胞數(shù)明顯高于假手術(shù)組，黃芩素組大鼠脊髓背角組織中c-Fos陽性細胞數(shù)明顯低于模型組，說明黃芩素對坐骨神經(jīng)壓迫引起的痛覺信息傳遞具有抑制作用，且其調(diào)控作用的部位位于初級感覺神經(jīng)元。以往研究［11-12］顯示：抗炎藥物對神經(jīng)病理痛的鎮(zhèn)痛作用并不理想，提示黃芩素是通過其他途徑對CCI大鼠模型產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用。

DRG初級傷害性感受神經(jīng)元興奮性增加是神經(jīng)病理痛發(fā)生的始發(fā)因素。本課題組以往研究［13］顯示：DRG初級感覺神經(jīng)元的興奮性在外周神經(jīng)損傷時明顯增強。外周神經(jīng)受損時，DRG初級感覺神經(jīng)元中傷害性感受相關(guān)受體表達增加，炎癥因子的作用和神經(jīng)元中痛覺相關(guān)信號分子水平的變化等參與初級感覺神經(jīng)元興奮性的增加。DRG中約60%神經(jīng)元表達GDNF相關(guān)受體。GDNF對痛覺分子異常表達有多靶點抑制作用，GDNF還可以從不同環(huán)節(jié)調(diào)控痛覺信息的傳遞［14］，對不同神經(jīng)病理痛動物模型均表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛作用［6］。有研究［15］顯示：大鼠脊髓損傷后，DRG中GDNF表達水平明顯降低。但是外周神經(jīng)損傷后，DRG中GDNF的表達是否發(fā)生改變尚未見報道。本研究結(jié)果顯示：坐骨神經(jīng)慢性壓迫后，大鼠DRG中GDNF表達水平明顯降低；提示外周神經(jīng)損傷時，初級感覺神經(jīng)元中GDNF表達的變化參與神經(jīng)病理痛的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示：腹腔注射黃芩素可明顯調(diào)節(jié)CCI大鼠DRG中GDNF的表達，說明黃芩素對神經(jīng)病理痛的鎮(zhèn)痛作用與其調(diào)節(jié)GDNF的表達有關(guān)。黃芩素可促進蛋白分子合成和分泌［16-17］，增加施萬（Schwann）細胞對神經(jīng)損傷的修復(fù)功能［18］。黃芩素對GDNF表達的影響作用已被最近的一項研究［19］證實。但黃芩素對GDNF表達的調(diào)節(jié)機制尚需進一步研究。以往研究［7］顯示：黃芩素可通過轉(zhuǎn)錄因子p-CREB發(fā)揮對多巴胺能神經(jīng)元的保護作用；p-CREB是調(diào)節(jié)GDNF的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。因此，黃芩素對DRG內(nèi)GDNF表達的調(diào)節(jié)可能通過p-CREB發(fā)揮作用。