于美玲，繆衛(wèi)媛，吳苑瀅，梁 穎，曹迷霞，韋英益*，王 蕾，胡庭俊*

(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.南寧市食品藥品檢驗所，廣西南寧 530005)

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)隸屬皰疹病毒科、皰疹病毒屬，雙股DNA病毒；PRV可以感染各個年齡段的豬，導(dǎo)致豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)，臨床表現(xiàn)為呼吸困難、發(fā)熱、腹瀉、角弓反張、共濟失調(diào)、繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)疾病[1]。豬偽狂犬病傳播速度快、途徑多、范圍廣，是危害全球50多個國家和地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一[2]。盡管在許多發(fā)達國家PRV已經(jīng)得到凈化，但2011年底，豬偽狂犬病在中國15個省份暴發(fā)，疫苗免疫接種的豬群感染強毒力PRV變異株，感染的新生仔豬病死率高達50%以上[3-4]。并且PRV可引起免疫缺陷，與日本腦炎病毒、沙門氏菌和大腸埃希氏菌等混合感染給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[5-6]。另外，PRV對許多哺乳動物均有致病性，如山羊、犬、兔子、大鼠、水貂等，研究表明PRV對人具有潛在致病性[7-9]。因此，急需明確PRV感染機制和研發(fā)有效疫苗和藥物。

PRV感染宿主后，首先在宿主的呼吸道和扁桃體上增殖，病毒可以經(jīng)由血液到達全身各個組織器官，導(dǎo)致肺炎、肺組織壞死、胃腸炎和腦炎等全身組織器官炎癥壞死[10-11]，誘導(dǎo)免疫細胞死亡[12]，引發(fā)免疫系統(tǒng)紊亂。肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage，AM)是宿主免疫系統(tǒng)中重要的免疫細胞[13]，具有吞噬和免疫調(diào)節(jié)功能，是病原微生物入侵肺部的第一道防線。而且AM是重要的炎性細胞之一，病原感染后產(chǎn)生大量活性氧，產(chǎn)生大量炎性因子，發(fā)動和延長細胞炎癥反應(yīng)，修復(fù)組織損傷，對維持肺的正常結(jié)構(gòu)和功能起到核心的作用[14]。因此，研究PRV對豬肺泡巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)的影響，對揭示PRV感染宿主的致病機制具有重要意義。

為了探究PRV體外感染免疫細胞是否引起氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，以及如何影響機體免疫調(diào)節(jié)，本試驗通過用PRV體外感染豬肺泡巨噬細胞系3D4/2細胞，探討PRV感染劑量與感染時間對3D4/2細胞中白細胞介素1β(interleukin 1 beta，IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、γ干擾素 (interferon gamma，IFN-γ)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)炎性因子含量及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、黃嘌呤氧化酶D(xanthine oxidase D，XOD)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、環(huán)氧合酶-1(cyclooxygenase-1，COX-1)和COX-2酶活性的影響，建立PRV感染免疫細胞的體外氧化應(yīng)激和炎癥模型，為進一步對PRV感染致病機制的研究和防控PRV感染藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和細胞系 PRV-GXLB-2013株，廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室提供；豬腎臟細胞(porcine kidney，PK-15)細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理實驗室保存提供；3D4/2細胞是豬肺泡巨噬細胞，由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理實驗室凍存。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液，美國GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清，維森特生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；0.5 mg/mL胰蛋白酶、L-谷氨酰胺，索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；Universal Genomic DNA Kit，康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品；2×master mix PCR酶，羅氏公司產(chǎn)品；NO、GSH、XOD、iNOS、MPO和ROS試劑盒(生產(chǎn)批號20171221)，南京建成生物工程研究所有限公司產(chǎn)品；IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、COX-1和COX-2 ELISA試劑盒(生產(chǎn)批號20171229)，江蘇晶美生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(C150)，德國BINDER公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡(TS100-F)，日本Nikon公司產(chǎn)品；多功能熒光酶標(biāo)儀(TECAN)，美國Perkin Elmer公司產(chǎn)品；紫外可見光分光光度計(UV1750型)，日本島津公司產(chǎn)品；梯度PCR儀(S1000)、全自動凝膠成像系統(tǒng)(Gel DocTMXR+)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠電泳儀(DYY-8C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PRV病毒毒價的測定 將濃度為1×105cells/mL的PK-15細胞懸液鋪于96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔100 μL，細胞置于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)12 h后棄去上清液，PBS洗滌3次，利用無血清DMEM將病毒液作10倍梯度稀釋(100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10)， 每孔加上述病毒稀釋液100 μL，空白對照組加入等量DMEM，每組設(shè)置6個重復(fù)。細胞板置于體積分數(shù)為5%的CCO2培養(yǎng)箱中，37 ℃孵育2 h后棄去病毒液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌3次，每孔加200 μL含50 mL/L胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM細胞維持液，置體積分數(shù)為5%的CCO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞并記錄細胞病變(cytopathic effect，CPE)出現(xiàn)孔數(shù)，試驗以最高稀釋度病毒感染孔不再出現(xiàn)CPE為止，所得數(shù)據(jù)按Reed-Muench法計算TCID50。

1.2.2 PRV感染3D4/2細胞試驗 按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=11.1將PRV病毒液接入3D4/2細胞，放置于體積分數(shù)為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)2 h，期間每隔30 min輕輕搖晃一下細胞瓶；棄去病毒液，用無菌0.01 mmol/L PBS洗滌細胞3次；加入5 mL 50 mL/L-FBS-DMEM培養(yǎng)基，細胞置于體積分數(shù)為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細胞病變(CPE)。分別于感染后0、4、6、8、12、24、48 h分別收集細胞上清，按照Universal Genomic DNA Kit說明書提取病毒DNA。利用特異性引物擴增PRV gE基因(上游引物序列：5′-CGGCTTCCACTCGCAGCTCTTCTC-3′，下游引物序列：5′-TGTGGGTCATCACGAGCACGTACAGC-3′)，擴增體系及程序參照PCR酶說明書。將5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照華濤等[15]建立的PRV熒光定量PCR檢測方法，使用熒光定量PCR擴增PRV gB基因，檢測PRV在3D4/2細胞上的增殖情況。熒光定量PCR上游引物序列：5′-GTCACCCGCGTGCTGATCGTCT-3′，下游引物序列：5′-GGCAACCACCGGCGCTACTTT-3′。

1.2.3 PRV感染3D4/2細胞存活率的測定 將2×105cells/mL 3D4/2細胞接種于96孔板培養(yǎng)后，將PRV按照MOI=0.000 111、0.001 11、0.011 1、0.111、1.11、11.1、111和1 110等8種不同的劑量進行接毒，培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，放置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm 吸光度(OD 450 nm)。細胞對照組為含細胞、培養(yǎng)基和CCK-8溶液，空白對照組為不含細胞、含培養(yǎng)基和CCK-8溶液。細胞活力(%)=(OD試驗組-OD空白對照組)/(OD細胞對照組-OD空白對照組)×100。

1.2.4 樣品的采集 將3D4/2細胞加入24孔板，每孔1 mL。培養(yǎng)過夜后棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗2次～3次，細胞對照組加入20 mL/L FBS-DMEM培養(yǎng)液200 μL，試驗組加入200 μL不同濃度PRV病毒液(MOI=0.000 111～1.11)。細胞培養(yǎng)板置于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃吸附2 h，期間每20 min搖晃1次，棄去病毒液，PBS清洗2次～3次后每孔加入1 mL含20 mL/L FBS-DMEM培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)4、8、12、24、48 h后，分別收集上清液和刮取細胞，用于相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.2.5 PRV感染3D4/2細胞ROS和NO水平的測定 取上清液，按照一氧化氮(NO)試劑盒說明書測定NO水平；按照活性氧(ROS)試劑盒說明書測定ROS水平。

1.2.6 PRV感染3D4/2細胞內(nèi)XOD、MPO、iNOS和GSH水平的測定 將刮取的細胞冰水浴超聲破碎3 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒說明書測定XOD、MPO、iNOS和GSH的水平。

1.2.7 PRV感染后3D4/2細胞上清液中COX-1和COX-2酶活性的測定 取細胞上清液，按照試劑盒說明書操作，測定COX-1和COX-2的酶活性。

1.2.8 PRV感染后3D4/2細胞上清液中細胞因子水平的測定 取細胞上清液，按照試劑盒說明書操作，測定IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ和MCP-1的含量。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行差異性檢驗，用LSD法進行多重比較。其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 病毒感染3D4/2結(jié)果

PRV在PK-15細胞上增殖后，按照Reed-Muench方法測定PRV擴增病毒液的TCID50是1×10-7.5/0.1 mL。PRV感染3D4/2細胞后陸續(xù)出現(xiàn)細胞病變(CPE)(圖1)，CPE主要表現(xiàn)：接毒后24 h細胞出現(xiàn)變圓、皺縮、發(fā)亮，破碎，逐漸拉網(wǎng)并脫落，呈現(xiàn)皰疹病毒特有的病變。PRV感染細胞6、12、24、48 h后經(jīng)PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果均可在388 bp處出現(xiàn)一條與預(yù)期大小一致的條帶(圖2)，且條帶亮度隨病毒感染時間增加而增亮。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明PRV感染3D4/2細胞后，0 h～8 h 病毒快速增殖，24 h和48 h病毒含量較大，與常規(guī)PCR檢測結(jié)果相符(圖3)。說明PRV能夠感染3D4/2細胞，并可在3D4/2細胞上增殖。

A.3D4/2細胞對照(40×)；B.PRV感染3D4/2 24 h(40×)

1.PRV陽性對照；M.DL 2 000 Marker；2.細胞對照；3～6.PRV感染后6 h～48 h；7.陰性對照

圖3 PRV在3D4/2細胞上增殖結(jié)果

2.2 PRV感染對3D4/2細胞存活率的影響

由圖4可知，與細胞對照組相比，當(dāng)MOI=111和1 110時，PRV感染3D4/2細胞48 h后極顯著抑制了細胞的活性(P<0.01)；MOI=11.1時顯著抑制了細胞活性(P<0.05)；其他劑量的PRV感染3D4/2細胞對細胞活性無影響(P>0.05)。

圖4 PRV感染對3D4/2細胞活性的影響

2.3 PRV感染對3D4/2細胞ROS和NO水平的影響

由圖5可知，與細胞對照組相比，按照MOI=1.11接毒PRV 8、12、24 h后細胞內(nèi)ROS水平顯著升高，NO水平于8 h和12 h顯著升高(P<0.05)；按MOI=0.111接毒PRV 24 h和48 h后細胞內(nèi)ROS水平顯著升高，NO水平于4、8、24 h顯著升高(P<0.05)；按MOI=0.011 1接毒PRV 8 h和48 h后，細胞內(nèi)ROS和NO水平顯著升高(P<0.05)；按MOI=0.001 11接毒48 h細胞內(nèi)ROS水平顯著升高，NO水平于4 h、24 h和48 h顯著升高(P<0.05)；按MOI=0.000 111接毒8 h細胞內(nèi)ROS水平顯著升高，NO水平于4、8、12、24、48 h顯著升高(P<0.05)。

圖5 PRV感染3D4/2細胞對ROS和NO產(chǎn)生的影響

2.4 PRV感染3D4/2細胞對細胞內(nèi)XOD、MPO、iNOS和GSH水平的影響

由圖6可知，與細胞對照組相比，按MOI=1.11接毒PRV 4、8、12、24、48 h后細胞內(nèi)XOD活性顯著升高，MPO活性于48 h顯著升高，GSH水平于4、12、24、48 h顯著降低(P<0.05)；按MOI=0.111和MOI=0.011 1接毒8 h和12 h后細胞內(nèi)XOD活性顯著升高，NOS活性于4 h、8 h和24 h顯著升高，GSH水平于4 h、8 h、12 h和24 h顯著降低(P<0.05)；按MOI=0.001 11接毒PRV 12 h和24 h后細胞內(nèi)XOD活性顯著升高，MPO活性于12 h顯著升高，iNOS活性于4、8、24、48 h顯著升高，GSH水平于8 h和12 h顯著降低(P<0.05)；按MOI=0.000 111接毒PRV 8、12、24、48 h后細胞內(nèi)XOD活性顯著升高，MPO活性于12 h顯著升高，iNOS活性于4、8、24 h顯著升高，GSH水平于4、8、12 h顯著降低(P<0.05)。

圖6 PRV感染3D4/2細胞對細胞內(nèi)XOD、MPO、iNOS活性和GSH水平的影響

2.5 PRV感染3D4/2細胞對細胞分泌COX-1和COX-2酶活性的影響

與細胞對照組相比，按MOI=1.11接毒PRV 12 h和48 h后細胞內(nèi)COX-1活性顯著升高，COX-2活性于24 h顯著升高(P<0.05)；按MOI=0.111接毒4 h、8 h和12 h后細胞內(nèi)COX-1活性極顯著升高(P<0.01)，COX-2活性于24 h和48 h顯著升高(P<0.05)；按MOI=0.011 1接毒PRV 4 h和12 h后細胞內(nèi)COX-1和COX-2活性極顯著升高(P<0.01)；按MOI=0.001 11接毒PRV 4 h和12 h后細胞內(nèi)COX-1活性極顯著升高(P<0.01)；按MOI=0.000 111接毒PRV 4 h和12 h后細胞內(nèi)COX-1活性顯著升高(P<0.05)，COX-2活性于48 h極顯著升高(P<0.01)(圖7)。

圖7 PRV感染3D4/2細胞對COX-1和COX-2酶活性的影響

2.6 PRV感染3D4/2細胞對細胞上清液中炎性因子水平的影響

與細胞對照組相比，按MOI=1.11接毒PRV 48 h后細胞內(nèi)IL-6和IL-8含量顯著升高，IL-10含量于4 h和24 h顯著升高，IFN-γ含量于4 h和12 h顯著升高，MCP-1含量于12 h和48 h顯著升高(P<0.05)，TNF-α含量于8、24、48 h顯著升高(P<0.05)；按MOI=0.111接毒PRV 4、12、48 h后細胞內(nèi)IL-1β含量顯著升高，IL-6含量于8、24、48 h顯著升高，IL-8含量于24 h極顯著升高，IL-10和IFN-γ含量于8 h和24 h顯著升高，MCP-1含量于8、12、48 h顯著升高，TNF-α含量于4、8、12、24、48 h顯著升高(P<0.05)；按MOI=0.011 1接毒PRV 8 h后細胞內(nèi)IL-6和IFN-γ含量顯著升高，IL-8含量于24 h極顯著升高，IL-10含量于8 h和24 h極顯著升高，MCP-1含量于8、12、24 h極顯著升高(P<0.01)，TNF-α含量于4、12、48 h顯著升高(P<0.05)；按MOI=0.001 11接毒PRV 4、12、48 h后細胞內(nèi)IL-6含量顯著升高(P<0.05)，IL-8和MCP-1含量于48 h極顯著升高(P<0.01)，IL-10含量于4、8、24、48 h顯著升高，IFN-γ含量于8、12、48 h顯著升高，TNF-α含量于8 h顯著升高(P<0.05)；按MOI=0.000 111接毒PRV 48 h后細胞內(nèi)IL-1β和IL-8含量極顯著升高(P<0.01)，IL-6含量于4 h和48 h顯著升高，IL-10含量于8、24、48 h顯著升高，IFN-γ含量于12 h顯著升高，MCP-1含量于4、12、48 h顯著升高，TNF-α含量于24 h和48 h顯著升高(P<0.05)(圖8)。

圖8 PRV感染3D4/2對細胞內(nèi)IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、MCP-1和TNF-α的含量的影響

3 討論

肺泡巨噬細胞是下呼吸道的第一道防線，在機體的先天免疫和獲得性免疫中有很重要的作用，能夠吞噬細菌或病毒等侵襲物[14]。3D4/2細胞是豬肺泡巨噬細胞(PAM)的體外傳代細胞系，雖然該細胞的吞噬功能已經(jīng)喪失，但保留著細胞因子分泌的功能，且其對許多豬病毒都易感，可應(yīng)用于研究病毒感染誘導(dǎo)細胞炎癥反應(yīng)的機制[13]。PRV是泛嗜性病毒，可以在許多細胞比如PK-15、Vero、ST等內(nèi)復(fù)制，并且可產(chǎn)生明顯的細胞病變(CPE)及出現(xiàn)核內(nèi)嗜酸性包涵體[16]。本研究中將PRV接毒于3D4/2細胞，細胞產(chǎn)生明顯的CPE，同時PRV感染對細胞的生長有很強的抑制作用，進一步證實了該3D4/2細胞的病變與PRV感染有直接的關(guān)系；采用PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PRV特異性擴增條帶隨感染時間延長而變亮，熒光定量PCR結(jié)果進一步證明PRV可感染3D4/2細胞，并可在3D4/2細胞上增殖。研究結(jié)果與Weingartl H M等[13]報道的3D4/2可支持PRV的復(fù)制相符。

PRV感染宿主后，常導(dǎo)致生殖系統(tǒng)炎癥、肺炎、胃腸炎和腦炎等全身組織器官炎癥壞死[10-11]。炎癥是機體對致炎因素的局部損傷而產(chǎn)生的具有一定防御意義的應(yīng)答性反應(yīng)，是發(fā)病學(xué)的基礎(chǔ)[17]。建立PRV感染細胞炎癥模型對研究PRV感染機制及研發(fā)抗PRV感染藥物意義重大。有學(xué)者利用LPS刺激巨噬細胞來模擬體內(nèi)炎癥反應(yīng)，通過建立人的子宮內(nèi)膜細胞體外炎癥模型研究子宮內(nèi)膜炎癥、出血和修復(fù)機制[18-19]。本研究利用PRV刺激豬肺泡巨噬細胞，分析PRV感染對3D4/2細胞活性影響，檢測不同時間段胞內(nèi)炎癥介質(zhì)的變化規(guī)律，模擬PRV感染體內(nèi)炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明高劑量PRV可顯著抑制細胞活性，所以本研究選定后續(xù)試驗MOI分別是0.000 111、0.001 11、0.011 1、0.111和1.11，不同劑量PRV感染3D4/2細胞4 h ～48 h能夠顯著或極顯著升高IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、NO和ROS炎性因子水平及COX-1、COX-2、XOD、MPO和iNOS酶活性，極顯著下調(diào)細胞內(nèi)GSH含量水平。

ROS、NO、iNOS、XOD和GSH水平是細胞的氧化還原狀態(tài)直接指標(biāo)[20-21]。病毒感染時，激活的巨噬細胞通過呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量ROS和NO，引起脂質(zhì)過氧化和抗氧化體系失調(diào)[20]，直接或間接影響酶活性，損傷DNA和蛋白質(zhì)，造成細胞損傷[22-23]。本研究中不同劑量PRV感染3D4/2細胞可引起ROS和NO水平極顯著升高，感染早期(4 h)細胞ROS水平?jīng)]有顯著變化，當(dāng)MOI=1.11時在感染中期(8、12、24 h)引起細胞ROS水平升高，隨感染時間延長(48 h時)，按MOI=0.111、0.011 1和0.001 11接毒PRV可引起細胞內(nèi)產(chǎn)生過量ROS，且ROS水平極顯著高于對照組。與ROS變化不同，NO水平在感染早期即顯著升高，低劑量PRV感染48 h內(nèi)可持續(xù)性引起細胞內(nèi)NO水平顯著升高。PRV感染后，巨噬細胞產(chǎn)生ROS和NO以抗病毒感染，調(diào)節(jié)下游效應(yīng)因子，發(fā)揮非特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。高劑量病毒在感染早、中期即可引起自由基水平顯著升高，在晚期損傷細胞，出現(xiàn)明顯病變(圖1)，自由基水平下降；iNOS主要存在于巨噬細胞等免疫細胞中，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO，與NO變化趨勢一致，PRV感染細胞早期可極顯著升高細胞iNOS活力，按MOI=0.111接毒PRV 24 h細胞iNOS活力最高，分析與此時病毒含量較高，引起機體應(yīng)答反應(yīng)也較強烈，上調(diào)的細胞因子誘導(dǎo)iNOS大量合成。XOD可催化發(fā)生氧化還原反應(yīng)可以使機體產(chǎn)生大量自由基而損傷細胞[24]，與ROS變化趨勢相似，低劑量PRV感染早期XOD活性無顯著變化，按MOI=0.111接毒PRV 8 h和12 h極顯著升高細胞的XOD活力，按MOI=1.11接毒PRV可持續(xù)性引起細胞XOD活力升高；MPO是過氧化物酶類，可以催化H2O2和Cl-產(chǎn)生HOCl，調(diào)節(jié)機體內(nèi)過氧化物的含量[21]，中、低劑量PRV感染細胞12 h極顯著升高細胞內(nèi)MPO活性，從而可以減少細胞中自由基，降低相關(guān)酶活性，這與我們發(fā)現(xiàn)的除MOI=1.11時，iNOS、NO和ROS水平在感染12 h無顯著變化的結(jié)果相符；GSH是體內(nèi)重要的還原物質(zhì)，對維持機體氧化還原平衡意義重大[21]，不同劑量PRV感染細胞均顯著下調(diào)細胞內(nèi)GSH水平，感染早期下調(diào)尤為明顯，而按MOI=0.111接毒PRV 48 h內(nèi)可持續(xù)性極顯著下調(diào)細胞內(nèi)GSH水平，引起細胞氧化還原狀態(tài)失衡。綜上分析，PRV感染后，細胞中iNOS酶活性首先升高，誘導(dǎo)產(chǎn)生NO；XOD酶活性后續(xù)升高，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS，消耗大量GSH；感染12 h時，機體代償產(chǎn)生大量MPO平衡機體氧化還原穩(wěn)態(tài)，所以中、低劑量PRV感染后期GSH含量恢復(fù)正常，而接毒劑量相對較大時GSH含量仍極顯著降低，以上結(jié)果表明不同劑量PRV感染3D4/2細胞4 h～48 h能夠改變3D4/2細胞的氧化還原狀態(tài)。

細胞的氧化還原狀態(tài)與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)，ROS可以激活巨噬細胞在內(nèi)的多種免疫細胞致使細胞分泌大量細胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2和iNOS等，從而引起全身性炎癥反應(yīng)[25-27]。而細胞因子TNF又可以誘導(dǎo)細胞分泌H2O2[27]，IFN-γ能夠誘導(dǎo)NO2-和H2O2釋放， IL-1β和TNF-α也能誘導(dǎo)巨噬細胞提高O2-的分泌表達[28]。研究顯示TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1、AP-1等很多因子的表達均能誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生iNOS，進而生產(chǎn)NO[29-30]。自由基可以誘發(fā)促炎細胞因子的基因表達，反過來促炎細胞因子也可以誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生，二者之間形成一個正反饋循環(huán)[31]。本研究中不同劑量的PRV感染后，細胞內(nèi)IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、COX-1和COX-2含量均有不同程度升高，細胞因子水平變化趨勢與細胞內(nèi)自由基水平變化趨勢相符。COX-1、IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1含量在PRV感染4 h時即顯著升高，COX-1在發(fā)生炎癥時會快速分泌促炎細胞因子IL-6、TNF-α等參與炎癥調(diào)節(jié)反應(yīng)過程[32]；IL-1β、IL-6、TNF-α均可以促進炎癥反應(yīng)[33]，MCP是炎癥趨化因子，以上因子水平的升高說明PRV感染早期即可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。按MOI=0.111接毒PRV 48 h內(nèi)可持續(xù)性顯著升高細胞內(nèi)TNF-α水平，MCP含量在PRV感染4 h～12 h 內(nèi)呈上升趨勢，引起細胞炎癥反應(yīng)明顯。IL-8和COX-2主要是在PRV感染后期表現(xiàn)為顯著升高。IL-8可引起呼吸爆發(fā)[34]，所以可引起ROS水平在感染24 h和48 h極顯著升高，加重炎癥反應(yīng)；COX-2是誘導(dǎo)型環(huán)加氧酶，PRV感染后炎癥細胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-6、 COX-1等)、生長因子、LPS等刺激物能刺激細胞表達COX-2[35]，參與炎癥反應(yīng)。雖然促炎細胞因子在抗病毒先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答是必不可少的[36]。但病毒感染期間，某些細胞因子的過量產(chǎn)生(又稱細胞因子風(fēng)暴)可損傷細胞和組織器官，引起疾病臨床癥狀的表現(xiàn)等[37-38]。本研究中高劑量PRV感染3D4/2細胞(MOI=1.11) 4 h時，中劑量PRV感染3D4/2細胞(MOI=0.111、0.011 1和0.001 11)8 h時，細胞產(chǎn)生IFN-γ增多以抵抗感染，而隨感染劑量和時間的增加，細胞抗病毒反應(yīng)減弱，說明細胞抗損傷能力減弱；IL-10可以抑制炎癥反應(yīng)[39]，在感染4 h和8 h時，細胞IL-10水平升高，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，但感染48 h時僅低劑量組(MOI=0.000 111)顯著升高，分析細胞已損傷，炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)能力下降。高劑量和長時間PRV感染易導(dǎo)致細胞炎性損傷，影響細胞因子分泌；同時由于各種炎性因子之間也存在著促進和抑制的作用，細胞因子變化比較復(fù)雜，所以本研究中細胞因子變化未表現(xiàn)劑量或時間依賴關(guān)系。綜合分析，按MOI=0.111接毒PRV感染3D4/2細胞可于不同時間點能夠顯著或極顯著升高IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、NO和ROS炎性因子水平及COX-1、COX-2、XOD、MPO和iNOS酶活性，極顯著下調(diào)細胞內(nèi)GSH含量水平，引起細胞氧化還原狀態(tài)失衡，誘導(dǎo)細胞炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究采用了PRV成功誘導(dǎo)了3D4/2細胞發(fā)生了氧化炎癥反應(yīng)，并確定了將PRV按照MOI=0.111體外感染3D4/2細胞8 h～48 h是建立3D4/2細胞炎癥模型的最佳條件。該模型能夠用于進一步研究PRV感染與3D4/2細胞之間存在的相關(guān)炎癥反應(yīng)過程，為PRV體外感染研究提供數(shù)據(jù)支持。