徐海玲，李夢(mèng)磊，高 睿，許信剛，張 琪

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程分院，陜西楊凌 712100)

流產(chǎn)衣原體(Chlamydiaabortus)和Q熱立克次體(Coxiellaburnetii)作為嚴(yán)格胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性微生物[1-2]，是一類在全世界流行范圍比較廣的人獸共患病病原，感染該病原不僅會(huì)降低動(dòng)物的生產(chǎn)性能，同時(shí)也能使人類感染及發(fā)病[3-4]。引發(fā)羊地方性流產(chǎn)病(EAE)的主要病原為流產(chǎn)衣原體，能使山羊、綿羊、奶牛等多種動(dòng)物感染，從而引發(fā)母畜流產(chǎn)和死胎，孕婦與患流產(chǎn)衣原體病的家畜直接接觸也可感染導(dǎo)致流產(chǎn)[5]；Q熱是由伯氏立克次體(Coxiellaburnetii)感染引起的廣泛分布于全球的人獸共患病之一，動(dòng)物感染Q熱后沒(méi)有明顯的癥狀，可能引發(fā)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱胎[6]；羊致病性大腸桿菌病不分季節(jié)都可感染羊發(fā)病，感染率和病死率都比較高，主要癥狀為水樣腹瀉和敗血癥[7]。2021年6月，甘肅省某規(guī)?；叹d羊養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生一起母羊流產(chǎn)同時(shí)伴有腹瀉病例導(dǎo)致3只母羊死亡。為確定流產(chǎn)及腹瀉的病因并為治療提供依據(jù)，無(wú)菌采集流產(chǎn)胎兒的肝臟、脾臟、胃和臍帶以及母羊的肝臟組織等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并經(jīng)藥敏試驗(yàn)篩選出的敏感藥物對(duì)同群病羊進(jìn)行治療。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 甘肅省某規(guī)?；叹d羊養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生流產(chǎn)和腹瀉的母羊，剖檢并無(wú)菌采集腹瀉母羊的肝臟、脾臟、腸內(nèi)容物各3份以及流產(chǎn)胎兒的肝臟、脾臟、臍帶和胃各4份。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 細(xì)菌常用培養(yǎng)基、靛基質(zhì)試劑等按文獻(xiàn)[8]介紹的方法制備；藥敏紙片、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、組織DNA提取試劑盒，睿時(shí)生物科技有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌生化鑒定管，杭州濱河微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 PCR儀(K960)，力康生物醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖電泳儀(DYCP-31DHDYY-6C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2F)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌鍋(XFS-280A)，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)(GenoSens 1800)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考文獻(xiàn)[9-10]針對(duì)羊流產(chǎn)衣原體和羊立克次體設(shè)計(jì)特異性引物：流產(chǎn)衣原體特異性擴(kuò)增引物為F：5'-CCCCAAGCCAGCATCTAATA-3'，R：5'-TTAGAGCCCAGGCAGTCTCG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為523 bp；立克次體引物序列為F：5'-TATGTATCCACCGTAGCCAGT-3'，R：5'-CCCAACAACACCTCCTTATTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為687 bp，引物交由西安熱默爾生物公司合成。

1.2.2 DNA提取與PCR鑒定 胃內(nèi)容物、臍帶研磨處理后，提取總基因組，以獲得的總基因組為模板，采用表1的引物參考文獻(xiàn)[9-10]進(jìn)行RCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送至邁浦生物科技有限公司測(cè)序，結(jié)果在NCBI上Blast比對(duì)。

1.2.3 細(xì)菌的分離 無(wú)菌取肝臟、肺臟深部組織分為兩部分，將一部分肝臟及肺臟組織參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行有氧培養(yǎng)12 h后取培養(yǎng)的菌液劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取邊界清晰的單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察；另外一部分肝臟及肺臟組織參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行厭氧培養(yǎng)后12 h后染色鏡檢觀察。

1.2.4 細(xì)菌生化試驗(yàn) 將有氧培養(yǎng)分離菌株的純培養(yǎng)物接種到細(xì)菌生化鑒定管中37 ℃ 24 h后觀察結(jié)果。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 按文獻(xiàn)[8]介紹的K-B法操作及判定。

1.2.6 小鼠致病性試驗(yàn) 挑取健康清潔級(jí)小鼠10只，隨機(jī)分為A、B兩組，每組5只，A組作為試驗(yàn)組在腹腔注射分離菌液0.2 mL/只(1×108CFU/mL)，B組作為對(duì)照組在腹腔注射0.2 mL/只的無(wú)菌生理鹽水。及時(shí)觀察小鼠的健康狀況，對(duì)試驗(yàn)組死亡小鼠及時(shí)解剖并制作肝、脾組織的涂片染色之后進(jìn)行鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定結(jié)果

PCR鑒定結(jié)果顯示，4份胃內(nèi)容物及臍帶樣品流產(chǎn)衣原體鑒定均擴(kuò)增出523 bp的條帶(圖1)；4份胃內(nèi)容物及臍帶樣品立克次體鑒定均擴(kuò)增出687 bp的條帶(圖2)。擴(kuò)增出的流產(chǎn)衣原體測(cè)序結(jié)果(圖3)通過(guò)NCBI Blast比較分析和流產(chǎn)嗜性衣原體同源性為100%；擴(kuò)增出的立克次體測(cè)序結(jié)果(圖4)通過(guò)NCBI Blast比較分析與伯氏立克次體同源性為100%。因此，4份樣品被鑒定為流產(chǎn)衣原體和立克次體共同感染。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～4.被檢測(cè)樣品；5.陰性對(duì)照

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～4.被檢測(cè)樣品；5.陰性對(duì)照

圖3 擴(kuò)增的流產(chǎn)衣原體測(cè)序結(jié)果

圖4 擴(kuò)增的立克次體測(cè)序結(jié)果

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及革蘭氏染色結(jié)果

在麥康凱培養(yǎng)基上形成肉眼可見(jiàn)的圓形、邊緣整齊、表面光滑，菌落中心部分呈現(xiàn)深紅色的單個(gè)菌落(圖5)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色后可在鏡下觀察到粉紅色、形態(tài)呈短桿狀、兩端圓滑的桿菌(圖6)。符合大腸埃希氏菌的特性。厭氧培養(yǎng)基未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。

圖5 麥康凱培養(yǎng)基菌落形態(tài)

圖6 染色鏡檢結(jié)果(1 000×)

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

按照文獻(xiàn)[11]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行該分離株的生化試驗(yàn)鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1，該分離株的生化特性與大腸埃希氏菌相符，因此，確定分離菌株為大腸埃希氏菌。

表1 分離株生化試驗(yàn)

2.4 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠感染后8 h出現(xiàn)精神萎靡，被毛粗亂等癥狀，在12 h全部死亡，對(duì)照小鼠無(wú)異常。剖檢試驗(yàn)組死亡小鼠從肝臟分離出大腸埃希氏菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

用13種常用藥敏紙片對(duì)分離出的大腸埃希氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如表2。

表2 13種藥敏紙片對(duì)分離株藥敏試驗(yàn)

3 討論

引起綿羊流產(chǎn)的原因很繁雜，疫病性因素主要包括如弓形蟲(chóng)病、新孢子蟲(chóng)病、衣原體病、Q熱以及藍(lán)舌病等；非疫病性因素如損傷及管理造成的流產(chǎn)、藥物不合理使用造成的流產(chǎn)以及應(yīng)激反應(yīng)造成的流產(chǎn)等[12-13]。Q熱和流產(chǎn)衣原體病作為引發(fā)流產(chǎn)的最主要病原，呈全球分布態(tài)勢(shì)。流產(chǎn)衣原體常呈地方性流行，羊只被衣原體感染后一般情況下不會(huì)發(fā)病，但是會(huì)導(dǎo)致懷孕母羊的流產(chǎn)以及產(chǎn)弱羔，我國(guó)某些地區(qū)綿羊流產(chǎn)衣原體病陽(yáng)性率高達(dá)47%[14]。動(dòng)物感染Q熱病原后大多沒(méi)有明顯的發(fā)病癥狀，但會(huì)引發(fā)懷孕母羊流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱胎，公羊不育等繁殖障礙問(wèn)題。由于Q熱在我國(guó)動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)體系中是被忽視的一類傳染病，日常監(jiān)測(cè)和早期診斷技術(shù)不足，導(dǎo)致Q熱在我國(guó)部分地區(qū)廣泛流行，陽(yáng)性率在2.63%～35.56%之間[15]。2021年6月，甘肅省某規(guī)?；叹d羊養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生一起母羊流產(chǎn)同時(shí)伴有腹瀉病例導(dǎo)致3只母羊死亡。為確定流產(chǎn)的原因，通過(guò)無(wú)菌采集流產(chǎn)胎兒的肝臟、脾臟、胃和臍帶等進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示本次研究檢測(cè)中的4份胎兒胃內(nèi)容物、臍帶全部為Q熱和流產(chǎn)衣原體雙重感染。該病例表明引起綿羊流產(chǎn)的病原不再是某一個(gè)病原單一的感染，混合感染將是未來(lái)的主要存在方式，這種現(xiàn)象給控制綿羊相關(guān)疾病帶來(lái)了困難。

進(jìn)一步對(duì)無(wú)菌采集腹瀉母羊肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，確定引起腹瀉的病原為大腸埃希氏菌，經(jīng)小鼠致病性試驗(yàn)和藥物敏感性試驗(yàn)可知，分離出來(lái)的大腸埃希氏菌具有較強(qiáng)的致病性和耐藥性，確定引起羊只死亡的病原為大腸埃希氏菌，該分離菌只對(duì)頭孢噻肟、諾氟沙星、左氟沙星敏感，對(duì)其他臨床常用藥物都表現(xiàn)不敏感。使用頭孢噻肟肌肉注射進(jìn)行治療，羊群腹瀉現(xiàn)象明顯改善。對(duì)于羊的腹瀉，獸醫(yī)臨床治療上都運(yùn)用抗菌藥物，由于臨床治療中不規(guī)范使用抗菌藥物導(dǎo)致大腸埃希氏菌耐藥性的發(fā)生越來(lái)越頻繁，將給獸醫(yī)臨床治療和公共衛(wèi)生以及養(yǎng)殖業(yè)本身都帶來(lái)不利的影響[17]。在養(yǎng)羊場(chǎng)中，當(dāng)需要藥物治療疾病時(shí)，必須首先針對(duì)性治療病原體。實(shí)驗(yàn)室確診后，再進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)選擇高效藥物，避免該流行病擴(kuò)散以及耐藥性的產(chǎn)生。

本次研究的意義在于為預(yù)防臨床上發(fā)生類似的Q熱立克次體、流產(chǎn)衣原體和大腸埃希氏菌混合感染提供數(shù)據(jù)參考，在臨床上除了加強(qiáng)對(duì)羊群的防疫外，還要提高飼養(yǎng)和管理水平，及時(shí)清掃環(huán)境衛(wèi)生，以減少此類混合感染的發(fā)生，一旦發(fā)生此類混合感染的疾病，要及時(shí)發(fā)現(xiàn)并治療，同時(shí)也為制定抗菌藥物的合理使用提供依據(jù)。